人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：顱腦損傷是一種常見損傷，據(jù)世界各國(guó)不同時(shí)期的統(tǒng)計(jì)資料顯示，其發(fā)生率占全身各部位創(chuàng)傷的9％～21％，致死、殘率居各種創(chuàng)傷首位。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展，無(wú)論是顱腦損傷的基礎(chǔ)研究、臨床探索，還是新技術(shù)的推介與應(yīng)用，都有了重大發(fā)展和巨大變革。由于新的診斷和分類、分型方法，以及多種檢查、診治手段的改進(jìn)和創(chuàng)新，使顱腦損傷的救治效果達(dá)到了新的高度，重型顱腦損傷死亡率明顯降低。但同時(shí)，隨著死亡率的下降，顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元壞死導(dǎo)致的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)和學(xué)習(xí)

2、記憶能力的缺失嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，是臨床治療的難題。神經(jīng)修復(fù)成為神經(jīng)科學(xué)必須面對(duì)的問題。
　　 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)改變了神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)觀念，開辟了神經(jīng)修復(fù)的新紀(jì)元。然而，用于人的神經(jīng)干細(xì)胞主要來(lái)源于流產(chǎn)胚胎，其有限的來(lái)源及倫理學(xué)的爭(zhēng)議使其應(yīng)用受到極大的限制。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來(lái)源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有高度自我更新能

3、力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，MSCs具有跨胚層分化為神經(jīng)外胚層起源組織細(xì)胞的潛能，因而，有望成為神經(jīng)修復(fù)的新型種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。以往骨髓MSCs是主要的MSCs來(lái)源，但其必須通過有創(chuàng)性的途徑獲得，而且其隨著年齡的增長(zhǎng)，干細(xì)胞數(shù)量顯著減少。近年來(lái)臍血MSCs作為MSCs新的來(lái)源，但也具有分離成功率低、培養(yǎng)困難等缺點(diǎn)。人類羊膜是胎膜的最內(nèi)層，由胚胎羊膜囊壁發(fā)育而成，薄而透明，在胎盤面與絨毛膜相貼，在胎兒出生后常被

4、丟棄。本研究從人的羊膜分離、培養(yǎng)MSCs，使其在體外大量擴(kuò)增，并將其移植于大鼠的腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的表型。并通過分組實(shí)驗(yàn)，證實(shí)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(amniotic-derived mesenchymal stem cell，AD-MSCs)移植可顯著改善腦創(chuàng)傷大鼠行為能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)

5、因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子因其與人體NGF的結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，生物效應(yīng)也無(wú)明顯的種間特異性，很早就被應(yīng)用于臨床。本研究通過隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)，證實(shí)NGF能夠提高人羊膜MSCs移植的治療作用。
　　 醫(yī)用生物蛋白膠(biologic fibrin glue，BFG)廣泛應(yīng)用于外科臨床，具有良好的組織相容性和完全的降解吸收性。醫(yī)用生物蛋白膠除具有生物止血和粘合

6、封閉作用之外，還具有緩釋劑的作用，與治療藥物合用，可在局部緩慢釋放，維持局部藥物有效濃度，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。本研究通過隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)，證實(shí)BFG對(duì)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(amniotic-derived mesenchymal stem cell，AD-MSCs)移植后的細(xì)胞遷移分布和治療作用的發(fā)揮，均有顯著意義。
　　 方法：無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜，PBS充分沖洗后剪成碎片，用0.25％的胰蛋白酶室溫消化30 min，

7、共3次，然后用含1.0 g/L的膠原酶Ⅳ和0.1g/L DNA酶Ⅰ的DMEM/F12培養(yǎng)液37℃消化1h，制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)基采用VDMEM：VF12=1：1的DMEM/F12加10％的胎牛血清(FBS)、bFGF(終濃度為20 nb/ml)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況定期換液、傳代。
　　 采用Feeney自由落體硬膜外撞擊法制作大鼠腦創(chuàng)傷模型。Wistar大鼠90只，每組18只，隨機(jī)

8、分為5組：A組：陰性對(duì)照組(Sham)，只開顱鉆孔不進(jìn)行硬膜外撞擊，不移植細(xì)胞；B組：損傷對(duì)照組(TBI+NS)，開顱鉆孔進(jìn)行硬膜外撞擊，1d后，在損傷區(qū)分點(diǎn)注射生理鹽水40μl；C組：羊膜細(xì)胞移植組(TBI+羊膜MSCs)；開顱鉆孔進(jìn)行硬膜外撞擊，1d后，在損傷區(qū)分點(diǎn)注射含人羊膜MSCs的生理鹽水40μl；D組：羊膜細(xì)胞移植和神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射組(TBI+羊膜MSCs+NGF)；開顱鉆孔進(jìn)行硬膜外撞擊，1d后，在損傷區(qū)分點(diǎn)注射含人羊膜M

9、SCs的生理鹽水40μl，術(shù)后連續(xù)2周每日腹腔注射0.5μgNGF;E組，纖維蛋白膠和細(xì)胞移植組(TBI+FG+羊膜MSCs)，開顱鉆孔進(jìn)行硬膜外撞擊，1d后，將羊膜MSCs分別與主體膠和催化劑混合，在損傷區(qū)用纖維蛋白膠專用注射器單點(diǎn)注射混合液40μl。每只大鼠移植細(xì)胞1×107個(gè)。
　　 5組大鼠分別于移植后2d及7d，根據(jù)平衡能力(6分)、翻身(2分)、支頭(2分)、行走(5分)、逃避(3分)、四肢的反應(yīng)(3分)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠

10、進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。于3周時(shí)采用Morris水迷宮儀訓(xùn)練5天后行大鼠學(xué)習(xí)和記憶評(píng)價(jià)。
　　 5組大鼠于移植后4w用10％水合氯醛腹腔麻醉處死，立即開胸經(jīng)心臟主動(dòng)脈插管，1min內(nèi)用1％肝素生理鹽水100ml快速灌注，然后用4％多聚甲醛溶液滴灌2h至全身稍變硬后取腦，放入4℃，4％多聚甲醛溶液中固定過夜。梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟并制成蠟塊，以損傷區(qū)為中心切片10張，將切片貼附于多聚賴氨酸處理的玻片上行免疫組化染色，檢測(cè)神經(jīng)元特異

11、性烯醇化酶和膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)。
　　 以hochest33258作移植羊膜MSCs的標(biāo)記物，另取大鼠按C組和E組制作模型，分別于移植后3d和2w腹腔注射10％水合氯醛麻醉處死，取損傷區(qū)腦組織，制作快速冰凍切片。以損傷區(qū)為中心連續(xù)切片，片厚8～10μm。切片立即置于熒光顯微鏡下觀察，以波長(zhǎng)為490nm的紫外光激發(fā)，觀察移植細(xì)胞存活、遷徙情況，并照相記錄。
　　 結(jié)果：行為學(xué)評(píng)分方面：術(shù)后2d，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、。移植后7d，C、D、E組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D、E與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 空間學(xué)習(xí)記憶能力方面：移植后3周水迷宮試驗(yàn)潛伏時(shí)間C、D、E組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D、E與c組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 羊膜MSCs能夠在損傷腦組織內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE和GFAP。將羊膜MSCs和醫(yī)用生物蛋白膠混合移植于腦損傷大鼠的腦內(nèi)，其能夠

13、在醫(yī)用生物蛋白膠內(nèi)存活并在局部微環(huán)境的作用下分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE和GFAP。NGF和醫(yī)用生物蛋白膠均可以提高NSE和GFAP的表達(dá)。
　　 移植后3d冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察可見標(biāo)記AD-MSCs發(fā)藍(lán)白色光，胞體清晰，形態(tài)完整，細(xì)胞呈條帶狀分布，細(xì)胞在條帶中央較為密集，在條帶周圍細(xì)胞分布逐漸稀疏，C、E兩組間無(wú)明顯差異。移植后2w觀察兩組均可見腦損傷區(qū)熒光標(biāo)記細(xì)胞片狀分布，細(xì)胞形態(tài)完整。兩組相較，腦損傷區(qū)C組熒光標(biāo)記細(xì)胞

14、分布稀疏，E組熒光標(biāo)記細(xì)胞分布密集。
　　 結(jié)論：1.AD-MSCs移植于大鼠的腦損傷區(qū)，分化后能表達(dá)NSE和GFAP，NGF和醫(yī)用生物蛋白膠均可顯著提高NSE和GFAP的表達(dá)。
　　 2.AD-MSCs移植治療腦創(chuàng)傷大鼠可促進(jìn)其行為能力及空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善，NGF和醫(yī)用生物蛋白膠均可增強(qiáng)療效。
　　 3.生物蛋白膠作為細(xì)胞載體，可用于羊膜MSCs移植治療腦組織損傷，有利于移植的羊膜MSCs在腦損傷局部增殖分