嗅球成鞘細(xì)胞復(fù)合PLGA導(dǎo)管對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)作用.pdf

1、雖然顯微外科技術(shù)的發(fā)展極大地提高了周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的質(zhì)量，但修復(fù)效果仍不令人滿意。尤其是嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除以及先天性畸形等原因引起的周圍神經(jīng)缺損，其修復(fù)與重建仍是臨床上治療的難點(diǎn)。自體神經(jīng)移植是目前臨床上首選的神經(jīng)重建方法，但由于供體神經(jīng)缺乏、修復(fù)長(zhǎng)度有限、供體區(qū)域功能喪失、神經(jīng)瘤和自發(fā)神經(jīng)痛等問(wèn)題，其臨床應(yīng)用受到很大限制。近些年來(lái)，隨著合成材料學(xué)、生物工程學(xué)等學(xué)科的不斷進(jìn)展，組織工程化人工神經(jīng)給人們帶來(lái)新的期望。嗅球成鞘細(xì)胞(olfa

2、ctoryensheathing cells，OECs)是一種特殊類型的膠質(zhì)細(xì)胞，具有很強(qiáng)的促進(jìn)軸突再生和形成髓鞘的能力。聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly(DL-lactide-co-glycolide)，PLGA)是一種生物可降解性合成材料，具有來(lái)源豐富、組織相容性好、可塑性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種較為理想的人工神經(jīng)支架材料。基于上述背景，本實(shí)驗(yàn)采用急性分離的OECs復(fù)合PLGA導(dǎo)管，伍用細(xì)胞外基質(zhì)凝膠修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，旨在尋找修

3、復(fù)周圍神經(jīng)缺損的可行方法，并豐富周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)理論。 本實(shí)驗(yàn)第一部分采用改良的Sasaki(2004年)方法，嗅神經(jīng)層和顆粒層取材、分離和培養(yǎng)OECs，培養(yǎng)3d后用NGFRp75、S-100進(jìn)行免疫熒光鑒定，以確定OECs的純度。第二部分將急性分離的OECs接種于PLGA膜上，通過(guò)倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察OECs在PLGA膜上粘附、生長(zhǎng)情況；MTT、流式細(xì)胞術(shù)等方法測(cè)定OECs接種于PLGA膜后細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化情

4、況，以探討PLGA與OECs的細(xì)胞相容性。第三部分建立10mm的大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)缺損模型，用CM-DiI標(biāo)記的OECs復(fù)合PLGA導(dǎo)管進(jìn)行修復(fù)，同時(shí)設(shè)OECs+硅膠管組，PLGA組和硅膠管組為對(duì)照，在術(shù)后8w的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞示蹤、再生神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià)和組織學(xué)評(píng)價(jià)、靶組織功能評(píng)價(jià)、逆行示蹤和脊髓前角細(xì)胞計(jì)數(shù)等檢測(cè)，從而探討OECs復(fù)合PLGA導(dǎo)管對(duì)坐骨神經(jīng)再生及靶組織功能恢復(fù)的促進(jìn)作用和對(duì)上位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用。 所取得的主要結(jié)果

5、如下： 1．倒置顯微鏡下，OECs立體感強(qiáng)，胞體清晰，呈雙極或多極，突起細(xì)長(zhǎng)。NGFRp75和S-100免疫熒光鑒定雙陽(yáng)性。急性分離的OECs純度為50％～60％。 2.PLGA組OECs形態(tài)特征與對(duì)照組無(wú)明顯差異。MTT檢測(cè)證實(shí)PLGA對(duì)OECs的代謝活動(dòng)無(wú)顯著影響(直接細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)為1級(jí))。PLGA組OECs的細(xì)胞周期與對(duì)照組無(wú)顯著差異，其DNA指數(shù)在正常范圍內(nèi)(1.0±0.1)，OECs為正常二倍體細(xì)胞，PLG

6、A對(duì)OECs無(wú)致癌作用，二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)機(jī)體無(wú)害。 3.CM-DiI標(biāo)記的OECs存活時(shí)間可達(dá)6w，移植細(xì)胞沿神經(jīng)縱軸分布，PLGA導(dǎo)管內(nèi)OECs的存活時(shí)間長(zhǎng)于硅膠管。 4.術(shù)后8w時(shí)，OECs+PLGA組足跟部潰瘍愈合率為83.3％，再生神經(jīng)相對(duì)直徑恢復(fù)率為58.0±2.9％，無(wú)自食現(xiàn)象，一般情況明顯優(yōu)于其它三組。橋接的PLGA導(dǎo)管具有光滑的神經(jīng)樣外表，與周圍組織無(wú)明顯粘連，表面有少量淺表血供形成；而硅膠管表面有一層結(jié)締

7、組織膜形成，表面無(wú)血供形成。 5.術(shù)后6w時(shí)，OECs+PLGA組首先出現(xiàn)感覺(jué)功能的改善，其平均回縮時(shí)間為3.05±0.11see，明顯短于同期其它三組(P<0.05)。術(shù)后8w時(shí)，OECs+PLGA組感覺(jué)功能繼續(xù)好轉(zhuǎn)，OECs+硅膠管組回縮時(shí)間也減至3.06±0.09sec，與PLGA組和硅膠管組差異顯著(P<0.05)。各組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在8w的觀測(cè)時(shí)間內(nèi)，均無(wú)明顯改善。OECs+PLGA組動(dòng)作電位的潛伏期最短(3.10

8、±0.11ms)，其神經(jīng)傳導(dǎo)速度為19.38±0.70m/s，與其它三組差異顯著(P<0.05)。OECs+PLGA組復(fù)合肌肉動(dòng)作電位的波幅為3.21±0.47mV.，也遠(yuǎn)高于其它三組(P<0.01)。 6.術(shù)后8w時(shí)，OECs+PLGA組腓腸肌濕重恢復(fù)率為67.22±4.46％，顯著高于其它三組。同時(shí)，OECs+PLGA組的運(yùn)動(dòng)終板單位數(shù)量最接近于正常，為55.5±3.7個(gè)，體積在四組中最大，長(zhǎng)軸為41.5±8.8pm，短軸為

9、22.5±3.8μm，也顯著優(yōu)于其它三組(P<0.05)。 7.術(shù)后8w時(shí)，各組逆行示蹤檢測(cè)均有陽(yáng)性神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)。OECs+PLGA組實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)陽(yáng)性神經(jīng)元個(gè)數(shù)百分比為77.1±3.0％，與OECs+硅膠管組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，但與PLGA組和硅膠管組差異顯著(P<0.05)。同時(shí)，OECs+PLGA組與OECs+硅膠管組的術(shù)側(cè)脊髓前角外側(cè)群大、中型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量分別為9.2±0.8個(gè)和9.2±0.4個(gè)，明顯高于無(wú)細(xì)

10、胞移植的兩組(P<0.05)。 8.術(shù)后8w時(shí)，再生神經(jīng)甲苯胺蘭染色計(jì)量結(jié)果示OECs+PLGA組再生神經(jīng)中段水平有髓神經(jīng)纖維密度為17713±2505/mm<'2>，明顯高于其它三組(P<0.05)。OECs+PLGA組的再生神經(jīng)中段總神經(jīng)纖維數(shù)為6627±1032，與OECs+硅膠管組無(wú)明顯差異(.P>0.05)，但明顯優(yōu)于無(wú)細(xì)胞移植的兩組(P<0.05)。再生神經(jīng)遠(yuǎn)段水平OECs+PLGA組和OECs+硅膠管組的上述兩項(xiàng)指

11、標(biāo)顯著優(yōu)于PLGA組和硅膠管組(P<0.05)。透射電鏡顯示再生神經(jīng)中段水平OECs+PLGA組有髓纖維的成熟度最高，無(wú)髓纖維數(shù)量最少，OECs+硅膠管組成熟度次之，PLGA組和硅膠管組最低。各組再生神經(jīng)遠(yuǎn)段水平透射電鏡觀察結(jié)果與中段相似。 以上結(jié)果表明： 1．PLGA對(duì)OECs的形態(tài)特征、增殖能力、細(xì)胞周期及倍體水平無(wú)顯著影響，PLGA與OECs具有良好的生物相容性，適于構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)。 2．CM-Di