攜帶人HCN4與Tbx3基因慢病毒共轉染對胚胎干細胞生物學活性的影響.pdf

1、目的：
　　 電子起搏器的局限性促使人們在緩慢性心律失常的治療中尋找新的途徑和方法，體外重新構建具有竇房結功能的細胞便是嘗試之一。目前主要以HCN4基因轉染干細胞，其雖能分化成心肌樣細胞，但由于缺乏竇房結標記基因，功能上與竇房結細胞仍有差距。Tbx3基因在胚胎發(fā)育成熟晚期存在于竇房結前體細胞中使之保留起搏功能并抑制竇房結前體細胞向心房肌細胞分化。同時Tbx3與腫瘤的發(fā)生密切相關，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳腺癌、膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤都存在T

2、bx3基因的過表達。本研究擬構建同時攜帶有人。HCN4基因、Tbx3基因及增強型綠色熒光蛋白基因(eGFP)的慢病毒顆粒，并研究HCN4和Tbx3對小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)細胞生物學活性的影響，為進一步通過HCN4、Tbx3共表達重建竇房結細胞功能奠定基礎。
　　 方法：
　　 1、慢病毒包裝及滴度測定
　　 用脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別包裹攜帶有目的基因的

3、hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四種目的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒，共轉染293 FT細胞，分別產(chǎn)生含有表達hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP基因的四種慢病毒顆粒，計數(shù)熒光克隆數(shù)目，并計算病毒滴度。
　　 2、干細胞穩(wěn)定轉染和篩選
　　 將獲得的四種慢病毒顆粒分別轉染小鼠ES細胞，48小時后于熒光顯微鏡下觀察轉染效果。將轉染成功

4、的細胞進行傳代擴增并進行挑克隆純化，RT-PCR進一步檢測目的基因表達情況。
　　 3、ES細胞生物學活性的評價
　　 觀察獲得的四種轉基因小鼠ES細胞的形態(tài)、熒光表達強度。MTT法測定各組ES細胞OD值，流式細胞儀分析細胞凋亡率。
　　 結果：
　　 1、hHCN4-hTbx3慢病毒顆粒的構建
　　 四質(zhì)粒轉染293 FT細胞后，根據(jù)熒光顯微鏡觀察結果表明成功構建hHCN4-hTbx3-eGFP

5、、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四種慢病毒顆粒。病毒滴度測定結果分別為4.7×107TU/ml、5.2×107TU/ml、4.5×107TU/ml、6.7×107TU/ml。
　　 2、轉基因ES細胞相關基因的表達檢測
　　 四種慢病毒轉染后的ES細胞挑克隆純化后熒光表達正常，RT-PCR示目的基因表達良好。
　　 3、ES細胞形態(tài)、凋亡等變化
　　 四種轉染小鼠ES細胞中，含hHC

6、N4-eGFP及eGFP細胞形態(tài)良好，熒光率較高，含hTbx3-eGFP和hHCN4-hTbx3-eGFP細胞狀態(tài)相對差，熒光雖然明顯，但表達不強，培養(yǎng)上清可見漂浮的死細胞。進一步的MTT和流式細胞儀(AnnexinV-PE)檢測示hTbx3-eGFP、hHCN4-hTbx3兩組細胞生長速度明顯減慢，凋亡率顯著增高(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.成功構建出HCN4-Tbx3基因的慢病毒顆粒。
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