人胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白的表達(dá)及其調(diào)控.pdf

1、本課題為研究間皮細(xì)胞在胸腔內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，分離培養(yǎng)原代胸膜間皮細(xì)胞，研究其在體外培養(yǎng)時(shí)的生物學(xué)特性；并對(duì)不同標(biāo)本來(lái)源的間皮細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比．以原代間皮細(xì)胞為研究對(duì)象檢測(cè)其水通道蛋白mRNA的表達(dá)及調(diào)控．對(duì)于認(rèn)識(shí)間皮細(xì)胞的功能及探討胸膜腔內(nèi)液體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理有重要價(jià)值． 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、胸膜間皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。利用兩種取材方法建立人胸膜間皮細(xì)胞(HPMC)體外培養(yǎng)模型，一是用胰蛋白酶-EDTA消化法，從人肺臟胸膜及壁胸

2、膜上分離胸膜間皮細(xì)胞：二是從胸腔積液中分離胸膜間皮細(xì)胞；進(jìn)行胸膜間皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)．用形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定． 二、胸膜間皮細(xì)胞水通蛋白1～10mRNA表達(dá)的檢測(cè)。利用體外培養(yǎng)的原代人胸膜間皮細(xì)胞，檢測(cè)人胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1～10mRNA的表達(dá)，用RT-PCR(reverse transaiption polyrmrease chain reaction)檢測(cè)水通道蛋白1～10(AQP<,1～10>)

3、mRNA在人胸膜間皮細(xì)胞上的表達(dá)． 三、地塞米松對(duì)人胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1 mRNA表達(dá)的影響。臟層與壁層胸膜組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)其AQP<,1>蛋白水平的表達(dá)；體外培養(yǎng)的人胸膜間皮細(xì)胞，給于糖皮質(zhì)激素(地塞米松)和糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑(RU486)干預(yù)，研究地塞米松對(duì)人胸膜間皮細(xì)胞AQP<,1>mRNA表達(dá)的影響．用RT-PCR檢測(cè)人胸膜間皮細(xì)胞上AQP<,1> mRNA的表達(dá)情況．實(shí)驗(yàn)分三組：地塞米松組；

4、地塞米松+RU486；對(duì)照組．分別給于不同濃度的藥物，作用不同時(shí)間，檢測(cè)不同組人胸膜間皮細(xì)胞AQP<,1> mRNA表達(dá)的差異． 研究結(jié)果： 一、細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞匯合后呈多角形鋪路石樣，電鏡下可見豐富的微絨毛和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示角蛋白、波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，抗Ⅷ因子相關(guān)單克隆抗體、抗人白細(xì)胞CD<,45>表達(dá)陰性；排除了成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的可能性：證實(shí)為人的胸膜間皮細(xì)胞．兩種方法

5、得到的細(xì)胞純度均在98％以上：具有較好的細(xì)胞活力．兩種取材方法均可以成功建立間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，方法學(xué)上均有可行性． 二、水通蛋白1～10 mRNA表達(dá)。人胸膜間皮細(xì)胞上AQP<,1～10>mRNA均有表達(dá)，AQP<,1>、AQP<,9>、AQP<,10>表達(dá)豐富.結(jié)合已知它們的功能，證實(shí)人胸膜間皮細(xì)胞參于胸腔內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)用其它小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)． 三、地塞米松干預(yù)實(shí)驗(yàn)。人臟層胸膜與壁層胸膜間皮細(xì)胞上均存在AQP<,1>蛋

6、白的表達(dá)，且胸膜下血管內(nèi)皮與紅細(xì)胞上也存在AQP<,1>蛋白的表達(dá)；地塞米松可以增加AQP<,1> mRNA的表達(dá)，且有劑量依賴性特點(diǎn)，干預(yù)組與其它兩組比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001=AQP<,1>的主要功能是參與水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，地塞米松增加胸膜間皮細(xì)胞上AQP<,1>mRNA的表達(dá)，為胸腔積液的治療提供理論依據(jù)． 研究結(jié)論： 一、兩種取材方法均可以成功建立間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，方法學(xué)上均有可行性；手術(shù)標(biāo)本所得細(xì)胞有