交感神經遞質對肝星狀細胞生物學行為的影響及其機制.pdf

1、本文應用膽總管結扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，檢測腎上腺素受體各亞型的表達與肝纖維化發(fā)展的關系；進一步在細胞水平分別給予去甲腎上腺素α受體及β受體的阻滯劑，檢測其對HSCs增殖、凋亡以及膠原代謝的作用，并探討交感神經遞質調控HSCs生物學行為的信號轉導機制，旨在闡明交感神經系統(tǒng)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制，從而尋求有效的預防和治療肝纖維化的新思路、新策略。實驗內容主要包括以下四部分： 第一部分肝纖維化過程中去甲腎上腺

2、素各受體亞型表達的動態(tài)變化 目的：研究肝纖維化過程中去甲腎上腺素各受體亞型表達的動態(tài)變化。 方法：膽總管結扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，HE、Masson染色觀察肝臟病理形態(tài)學變化，免疫組織化學法檢測HSCs活化指標α-SMA的表達，Western blot和Real-time Q-PCR檢測α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白和mRNA的表達。 結果：①術后大鼠一般情況觀察：大鼠膽總管結扎后1 h～2 h

3、恢復活動，48 h左右尿液變黃，3～4天后皮膚毛發(fā)開始轉黃，精神逐漸變差，進食量少于對照組，體重增加不明顯或稍有下降。5～6天一般狀況漸差，嗜睡，反應遲緩，活動減少，黃疸明顯，鼠糞呈灰白色。20天后進食量明顯減少，體重與對照組相比明顯降低，并且部分大鼠逐漸出現腹部隆起。②肝組織病理組織學變化：模型大鼠肝臟肉眼觀呈褐綠色或棕色，表面略呈細顆粒狀，質地變硬。HE及Masson三色染色顯示，假手術對照組肝小葉結構完整，肝板排列整齊，肝細胞無腫

4、脹，無膽管增生，無淤膽及淋巴細胞浸潤，核仁清晰，少量結締組織局限于門管區(qū)。造模1 wk后，模型組肝細胞出現散在變性、壞死及炎細胞浸潤，部分區(qū)域出現小片狀壞死，門管區(qū)小膽管樣上皮細胞增生。造模2 wk后，模型組肝板正常排列消失，肝小葉結構紊亂，門管區(qū)小膽管廣泛增生，并向小葉內延伸、肝小葉呈花環(huán)狀；新生小膽管周圍纖維組織增生，門管區(qū)面積擴大，肝小葉內亦有纖維組織增生。造模3 wk～4 wk后，模型組肝臟廣泛纖維結締組織增生，增生的纖維間隔互

5、相連接、包繞、分割，改建原來的肝小葉甚至形成假小葉。Masson三色染色膠原面積密度測定結果顯示：模型組1 wk、2 wk、3wk、4 wk膠原面積密度(10.11％±1.14％，21.14％±1.22％，28.87％±2.05％，37.44％±3.17％)均顯著高于假手術對照組(3.22％±0.77％)，P<0.01。③α-SMA免疫組織化學染色顯示：正常大鼠肝組織中僅在血管壁平滑肌細胞有弱陽性表達；隨著肝纖維化的發(fā)展，大鼠肝組織中α

6、-SMA陽性細胞明顯增多，主要分布于匯管區(qū)、纖維間隔、肝竇周圍及增生的膽管周圍細胞，造模1 wk～4 wk大鼠肝組織α-SMA的陽性面積(10.58％±1.75％，24.14％±2.02％，29.74％±2.59％，34.28％±2.01％)均顯著高于假手術組(4.12％±1.51％)，P<0.01。即肝纖維化程度越重α-SMA 染色陽性細胞數量亦越多。④Western blot檢測結果顯示，分別在大約57 kD、50 kD、47kD位

7、置出現α-AR、β1-AR、β2-AR特異性條帶，在43 kD位置可見β-actin條帶。假手術組有少量腎上腺素受體蛋白表達，隨著肝纖維化進展其表達逐漸增加，造模1wk～4 wk大鼠肝組織α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白表達量明顯升高(1.54±0.08，1.87±0.15，2.72±0.09，2.84±0.18 vs 0.85±0.12，P<0.05；1.57±0.18，1.92±0.11，2.51±0.17，2.89±0.19

8、vs 0.98±0.15，P<0.05；1.84±0.20，1.97±0.09，2.85±0.14，3.87±0.1 8 vs 1.24±0.18，P<0.05)。⑤Real-time Q-PCR共擴增檢測α-AR、β1-AR、β2-AR和內參照GAPDH基因表達，根據：△c(t)實驗組=c(t)目的基因—c(t)GAPDH，Ac(t)對照組=c(t)目的基因—c(t)GAPDH，△△c(t)=△c(t)實驗組—△c(t)對照組，目的基

9、因的相對表達量folds=2-△△c(t)計算α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA相對表達量。結果證實，隨著肝纖維化的發(fā)展，α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA表達逐漸上調，造模4 wk表達最多(1.54±0.08，2.98±0.09，3.23±0.11，3.94±0.13 vs 1.00±0.07，P<0.01；1.47±0.10，2.13±0.09，2.54±0.12，2.81±0.10 vs 1.00±0.10，P<0

10、.01；1.24±O.07，2.78±0.10，3.54±0.14，4.24±0.15 vs 1.00±0.08，P<0.01)。⑥α-SMA與α-AR、β1-AR、β2-AR的多元相關分析顯示，α-SMA與α-AR、β1-AR及β2-AR呈正相關，r值分別為0.564、0.753和0.606。 結論：膽總管結扎法成功建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，肝纖維化形成過程中HSCs大量活化、增殖，α-SMA表達增加。隨著肝纖維化進展，

11、α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白及mRNA含量明顯增加，與α-SMA呈明顯的正相關。 第二部分交感神經遞質NE對HSCs生物學行為的影響 目的：探討交感神經遞質去甲腎上腺素對體外培養(yǎng)的肝星狀細胞增殖、凋亡及膠原代謝的影響。 方法：體外培養(yǎng)HSCs，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測NE對HSCs增殖的影響；原位雜交凋亡檢測(TUNEL)法觀察NE對HSCs凋亡的影響；流式細胞術檢測細胞凋亡率及細胞凋亡調控基因b

12、cl-2和bax的蛋白表達情況；倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；用Real-time Q-PCR檢測I型膠原mRNA的表達；并用Western blot和Real-time Q-PCR檢測MMP-13和TIMP-1蛋白和mRNA的表達。 結論：交感神經遞質NE對體外活化的HSCs具有促進增殖和抑制凋亡的作用，并引起凋亡調控基因bax表達下降，而bcl-2表達增加。NE還可以使HSCs MMP-13表達降低，TIMP-1表達升高

13、，進而降低MMP-13/TIMP-1比值，從而減少其對肝臟膠原降解的作用，使HSCs Ⅰ型膠原表達量增加，從而加速肝纖維化的進展。 第三部分去甲腎上腺素各受體亞型對HSCs生物學行為的調控作用 目的：探討交感神經遞質去甲腎上腺素各受體亞型對肝星狀細胞生物學行為的影響。 方法：體外培養(yǎng)HSCs，Western blot檢測HSCs腎上腺素受體(α-AR、β1-AR及β2-AR)蛋白的表達；免疫細胞化學法檢測腎上腺素

14、受體亞型在HSCs的分布與定位；Real-time Q-PCR檢測HSCs腎上腺素受體α-AR、β1-AR及β2-AR)mRNA的表達。細胞干預分為以下6組：①空白對照組，為單純HSCs培養(yǎng)；②交感興奮組(NE)；③α-AR阻滯組(酚妥拉明)；④β1-AR阻滯組(CGP20712A)；⑤β2-AR阻滯組(ICI118551)；⑥交感抑制組(酚妥拉明+普萘洛爾)。MTT法測定細胞增殖；TUNEL法觀察HSCs凋亡狀況；流式細胞術檢測細胞凋

15、亡率及凋亡調控基因bax和bcl-2的變化；Real-time Q-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達；并用Western blot和Real-time Q-PCR檢測MMP-13和TIMP-1蛋白和mRNA的表達。 結論：HSCs可以表達α-AR、β1-AR和β2-AR腎上腺素受體蛋白和mRNA，主要分布于HSCs的細胞膜和細胞漿。α-AR、β1-AR和β2-AR特異性阻滯劑均可以抑制HSCs增殖、誘導其凋亡。并可以拮抗NE引起

16、的凋亡基因的變化，使bax表達下降，bcl-2表達升高。其中，α-AR阻滯劑酚妥拉明和β2-AR阻滯劑ICI118551效果最明顯。NE受體阻滯劑促進HSCs MMP-13表達，顯著降低TIMP-1表達，MMP-13/TIMP-1比值回升；Ⅰ型膠原mRNA表達亦明顯降低。 第四部分 NE調控HSCs生物學行為的信號轉導機制 目的：探討交感神經遞質去甲腎上腺素對肝星狀細胞生物學行為影響的信號傳導機制。 方法：體外培

17、養(yǎng)HSCs，加入PI-3K信號通路抑制劑LY294002，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測NE對HSCs增殖的影響；TUNEL法和流式細胞術檢測凋亡情況；Western blot檢測PI-3K蛋白表達的變化情況。 結果：①NE促進HSCs增殖，加入PI-3K信號通路抑制劑LY294002后細胞增殖受抑制；②NE作用于HSCs 24 h，TUNEL法和流式細胞術均證實HSCs凋亡率顯著低于對照組，加入PI-3K信號通路抑制劑LY2