組胺作為一種交感神經(jīng)遞質(zhì)的新證據(jù).pdf

1、背景與目的: 組胺（Histamine, HA）是人體內(nèi)重要的自體活性物質(zhì)，具有廣泛的生理作用，同時(shí)也參與介導(dǎo)多種疾病的病理生理過(guò)程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，存在完整的HA 能神經(jīng)體系，HA 作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)參與介導(dǎo)認(rèn)知記憶、睡眠覺(jué)醒、飲水?dāng)z食等功能。在外周組織中，HA 主要以肥大細(xì)胞源和非肥大細(xì)胞源兩種形式貯存。肥大細(xì)胞來(lái)源的HA 參與介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的病理過(guò)程，非肥大細(xì)胞源性HA 的生理和病理作用尚不十分清楚。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，非肥大細(xì)胞來(lái)源的

2、HA 存在于大鼠外周胃腸道的神經(jīng)、頸上神經(jīng)節(jié)（Superior cervical ganglion,SCG）、頸動(dòng)脈體感覺(jué)神經(jīng)元等，提示HA 可能與這些神經(jīng)元的活動(dòng)有關(guān)。 我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，在豚鼠SCG 的神經(jīng)元內(nèi)，參與合成HA 的組胺酸脫羧酶（Histidine decarboxylase, HDC）與合成去甲腎上腺素（Norepinephrine,NE）的酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）和

3、多巴胺β羥化酶（Dobamine-β-hydroxylase, DβH）共存，而且HA 和NE 也共存其中；刺激交感神經(jīng)末梢能使HA 和NE 從交感神經(jīng)末梢共釋放；激動(dòng)交感神經(jīng)末梢突觸前膜HA H3 受體能夠負(fù)反饋調(diào)控HA 和NE 的釋放。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們首先提出HA 很可能是一種尚未被認(rèn)識(shí)的新的交感神經(jīng)遞質(zhì)，并提出HA 參與負(fù)反饋調(diào)控交感神經(jīng)傳遞的假說(shuō)。然而HA 與NE 在交感神經(jīng)元內(nèi)的共存是否具有普遍性？HA 在交感神經(jīng)元內(nèi)的

4、亞細(xì)胞定位如何？ HA 從交感神經(jīng)元內(nèi)釋放是否遵循經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)囊泡釋放的規(guī)律？這些都是為最終定義HA 作為一種新的交感神經(jīng)遞質(zhì)所必須回答的問(wèn)題。 基于以上問(wèn)題，本研究采用免疫熒光多重標(biāo)記、順行示蹤及激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察HA 在不同種屬動(dòng)物交感神經(jīng)節(jié)與交感神經(jīng)末梢的分布，及其與NE 的共存；采用包埋前免疫電鏡技術(shù)觀察HA 在交感神經(jīng)末梢和培養(yǎng)交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的亞細(xì)胞定位；在新生豚鼠原代培養(yǎng)SCG 細(xì)胞上，利用FM1

5、-43 熒光染料研究HA 突觸囊泡釋放、運(yùn)動(dòng)的循環(huán)動(dòng)力學(xué)，為最終證實(shí)HA 是一種新的交感神經(jīng)遞質(zhì)提供新證據(jù)。開(kāi)展這一領(lǐng)域的研究對(duì)于揭示交感神經(jīng)的新功能，深入認(rèn)識(shí)交感神經(jīng)功能紊亂疾病相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，尋找新的具有潛在治療可能性的藥物新靶點(diǎn)等都具有重要的理論意義。 結(jié)果: 1. 組胺和NE 在不同動(dòng)物交感神經(jīng)系統(tǒng)的共存分布本研究采用免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在小鼠SCG、狗SCG 和腹腔交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)，

6、以及小鼠和豚鼠輸精管、腸系膜動(dòng)脈的交感神經(jīng)神經(jīng)末梢中均有HA 和NE 共存。在小鼠和狗的SCG 中，NE樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)元中HA 的雙標(biāo)率分別為70％ 和40％，狗腹腔節(jié)中NE 樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)元中HA 的雙標(biāo)率為60％。在小鼠和豚鼠的輸精管、腸系膜動(dòng)脈標(biāo)本上，NE 樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維中HA 的雙標(biāo)率分別為80％ 和30％。在豚鼠SCG 局部微量注射順行示蹤劑生物素化葡聚糖胺（Biotinylateddextranamine, BDA），取

7、豚鼠心臟標(biāo)本，采用免疫熒光三重標(biāo)記技術(shù)觀察自SCG 投射到心臟的交感神經(jīng)纖維和末梢中HA。結(jié)果顯示，BDA 順行示蹤投射到心臟的交感神經(jīng)纖維中，20％ 的示蹤神經(jīng)纖維呈HA 樣免疫陽(yáng)性反應(yīng)，10％ 示蹤神經(jīng)纖維呈現(xiàn)HA 和NE 樣免疫陽(yáng)性反應(yīng)。上述結(jié)果在細(xì)胞水平確定HA 廣泛分布于不同種屬動(dòng)物的交感神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，并與NE 共存，為定義HA 作為新的交感神經(jīng)遞質(zhì)提供了直接的形態(tài)學(xué)證據(jù)。 2. 組胺在交感神經(jīng)末梢及培養(yǎng)SCG 神經(jīng)元

8、中的亞細(xì)胞定位在支配豚鼠輸精管交感神經(jīng)末梢內(nèi)，以及原代培養(yǎng)的豚鼠SCG 神經(jīng)元內(nèi)，利用HA 包埋前免疫電鏡技術(shù)，電鏡觀察顯示，HA 樣免疫陽(yáng)性物質(zhì)定位于直徑約50 nm 的小囊泡內(nèi)，且HA 陽(yáng)性囊泡約占囊泡總數(shù)的90％ 以上，大囊泡（直徑＞100 nm）及個(gè)別小囊泡無(wú)HA 免疫陽(yáng)性物質(zhì)。結(jié)果表明，交感神經(jīng)元內(nèi)HA 主要存在于小囊泡中，本項(xiàng)結(jié)果在亞細(xì)胞水平為定義HA作為新的交感神經(jīng)遞質(zhì)提供了直接的形態(tài)學(xué)證據(jù)。 3. 培養(yǎng)SCG

9、神經(jīng)突起部位組胺突觸囊泡循環(huán)動(dòng)力學(xué)利用FM1-43 熒光染料，結(jié)合HA 免疫熒光染色，在培養(yǎng)豚鼠SCG 神經(jīng)元突起上觀察HA 囊泡的釋放動(dòng)力學(xué)和HA 囊泡的運(yùn)動(dòng)過(guò)程，激光共聚焦顯微鏡成像并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。脫色（Destaining）研究結(jié)果顯示，SCG 神經(jīng)突起中HA 的紅色熒光信號(hào)強(qiáng)度與FM1-43 綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度隨除極刺激作用時(shí)間的增加，而呈現(xiàn)同時(shí)逐漸減弱的現(xiàn)象，兩者呈顯著正相關(guān)（r =0.989, P < 0.01），表明HA 的

10、釋放遵循囊泡釋放動(dòng)力學(xué)的普遍規(guī)律。在除極作用的不同時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞，分別測(cè)定代表HA 的紅色熒光強(qiáng)度和代表FM1-43 的綠色熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明HA 的紅色熒光強(qiáng)度要強(qiáng)于FM1-43 的綠色熒光強(qiáng)度。由于在本研究采用的除極條件下，F(xiàn)M1-43 熒光信號(hào)主要反映循環(huán)囊泡的釋放情況，HA 與FM1-43 的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)差異的結(jié)果提示，在神經(jīng)突起部位貯存HA 的囊泡可能存在可釋放囊泡庫(kù)和儲(chǔ)備囊泡庫(kù)之分。 熒光漂白恢復(fù)（Fluoresc

11、ence recovery after photobleaching, FRAP）結(jié)合免疫組織化學(xué)研究結(jié)果顯示，在SCG 神經(jīng)突起處含有HA 囊泡的擴(kuò)散速度為0.09μm2/s，其他囊泡為0.08 μm2/s。HA 囊泡的運(yùn)動(dòng)過(guò)程與其他囊泡無(wú)顯著性差異。 結(jié)論： 1. HA 普遍存在于多種動(dòng)物的交感神經(jīng)系統(tǒng)，并與經(jīng)典交感神經(jīng)遞質(zhì)NE共存。 2. HA 主要貯存于交感神經(jīng)突觸小囊泡內(nèi)。 3. 交感神經(jīng)