非融合雙靶點重組TK-IRES-Tum5腺相關病毒構建及體外實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　前列腺癌(prostate cancer,PCa)持續(xù)增長的發(fā)病率和持續(xù)增加的死亡率是目前非常重要的一個公眾問題。目前治療PCa的方法包括外科手術、放射治療和內分泌治療等。但是這些方法對激素非依賴PCa治療效果不夠理想?；蛑委熓悄壳坝锌赡苤斡[瘤的一種方法。本實驗構建腫瘤血管內皮抑素功能片段(Tum5)和自殺基因(TK)非融合重組腺病毒相關病毒(adeno-associated virus,AAV),AAV感染P

2、Ca細胞后持續(xù)地表達、分泌Tum5蛋白,阻止腫瘤內部新生血管形成,雙靶位治療PCa。
　　目的:
　　1.構建pAAV-TK、pAAV-Tum5、pAAV-TK-IRES-Tum5、pAAV-Tum5-IRES-TK質粒。
　　2.rAAV-TK、rAAV-Tum5、rAAV-TK-IRES-Tum5、rAAV-Tum5-IRES-TK病毒顆粒的包裝、濃縮、純化與鑒定。
　　3.基因重組腺相關病毒rAAV-TK、

3、rAAV-Tum5、rAAV-TK-IRES-Tum5、rAAV-Tum5-IRES-TK的體外功能實驗。
　　方法:
　　1.通過基因重組技術將Tum5和HSV-TK基因克隆入pIRES-MCS的不同位點,構建pAAV-TK、pAAV-Tum5、pAAV-TK-IRES-Tum5、pAAV-Tum5-IRES-TK質粒,通過酶切鑒定載體質粒正確。
　　2.采用HEK293細胞包裝病毒AAV Help free系統(tǒng)轉染

4、;采用氯仿-PEG/NaCl-氯仿抽提分離、濃縮和純化病毒。
　　3.培養(yǎng)人前列腺癌細胞(PC3)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC),通過熒光顯微鏡、實時定量PCR、Western blot檢測病毒感染效率,通過倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況,通過流式細胞儀和MTT法觀察細胞的凋亡情況和細胞周期變化。
　　結果:
　　1.成功構建pAAV-TK、pAAV-Tum5、pAAV-TK-IRES-Tum5、pAAV-Tum5-IR

5、ES-TK質粒。成功得到濃縮的重組腺相關病毒 rAAV-Tum5、rAAV-TK、rAAV-Tum5-IRES-TK、rAAV-TK-IRES-Tum5。
　　2.rAAV-Tum5、rAAV-TK、rAAV-Tum5-IRES-TK、rAAV-TK-IRES-Tum5均能夠順利感染PC3及HUVEC細胞,并能夠表達目的蛋白,Tum5蛋白能夠抑制HUVEC的成管能力,促進HUVEC凋亡,轉染TK基因的PC3細胞凋亡細胞比例要遠大于