重慶地區(qū)兒童呼吸道博卡病毒感染特點.pdf

1、研究背景 急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection，ARTI)是兒科臨床中最為常見的疾病，也是5歲以下兒童死亡的重要原因。呼吸道感染的病原十分復雜，病毒在其中占有很大的比重，如呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒(A，B型)、副流感病毒(1，2，3型)和腺病毒(AdV)等。但迄今為止仍有相當部分兒童急性呼吸道感染的病原未能闡明，使針對性預防和治療力度大大減低，且可能

2、間接造成抗生素濫用。因此，逐步闡明兒童呼吸道感染中這部分未知病毒病原的構成、發(fā)病率及特征具有十分重要的實踐意義。 2005年8月22日，瑞典學者 Tobias Allander采用隨機PCR擴增，測序并結合生物信息學方法對兒童急性呼吸道感染樣本進行大規(guī)模篩查，發(fā)現(xiàn)一種新的細小病毒，命名為人博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)。它與牛細小病毒(Bovine parvovirus，BPV)和豬細小病毒(Minutev

3、irus of Canine，MVC)同屬細小病毒亞科中的博卡病毒屬。此后，澳大利亞、日本、加拿大、法國、德國、韓國、美國等國家相繼檢測到該病毒，提示其全球流行。從目前研究資料看，HBoV 感染的發(fā)病率為1.5％-18.3％，在不同年齡組人群中都可致急性呼吸道感染，但5歲以下兒童感染率較高，尤以6個月至2歲常見。有關HBoV的血清流行病學、免疫發(fā)病機制及防治手段的研究則尚未見報道。在國內，中國疾病預防控制中心對湖南郴州市兒童呼吸道博卡病

4、毒感染進行了報道。浙江省亦在急性下呼吸道感染患兒的鼻咽吸取物中檢測到HBoV，還建立了博卡病毒的熒光定量PCR檢測方法。廣州地區(qū)利用原核表達的HBoV VP1蛋白，進行了血清流行病學調查，陽性率為7.06％。但以上課題組的研究，多是在冬季收集標本，標本量亦較小。 目的 分析HBoV感染的發(fā)病、分布季節(jié)、年齡、臨床表現(xiàn)等情況，證實其亦為重慶地區(qū)兒童急性呼吸道感染的病原之一并初步闡明其分子流行病學規(guī)律，為進一步的防治研究提供

5、理論依據。 方法 1．標本收集：2006年4月-2007年3月，在重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸內科病房收集因呼吸道感染住院患兒的鼻咽吸取物標本。 2．直接免疫熒光法(DFA)檢測標本中的常見呼吸道病毒感染情況：標本處理后，細胞沉渣用于直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、流感病毒A、B亞型、副流感病毒1、2、3型及腺病毒。 3．用PCR方法檢測標本中HBoV：標本收集后，取200μl用QIAamp DNA M

6、ini Kit(QIAGEN Inc，USA)提取病毒基因組DNA，提取的DNA用于HBoV的NS1基因及NP-1基因核酸片斷的擴增。 4．流行病學分析：分析HBoV檢出陽性率、HBoV感染的季節(jié)分布、年齡分布特點等； HBoV與其它呼吸道病毒病原協(xié)同感染情況等。 5．HBoV陽性標本患兒臨床資料分析：患兒的入院診斷、主要癥狀、實驗室檢查、X線表現(xiàn)特點等。 6．序列測定及比對分析：將陽性PCR 產物進行序列分析，

7、與GeneBank中的HBoV ST1和HBoV ST2序列比對；并運用ClustalX及DNAStar軟件對其遺傳進化發(fā)生和核酸、氨基酸的同源性進行分析。 結果 1．在2006年至2007年一年期間，共收集呼吸道感染住院患兒鼻咽吸取物標本395份。 2．PCR檢測：395份鼻咽吸取物中共檢測到21份陽性擴增產物，陽性率為5.3％(21/395)。NP-1基因產物約為354bp，NS1基因產物約為291bp。將兩

8、個基因片斷均成功擴出的標本作為陽性標本。 3．在21份鼻咽分泌物HBoV PCR 陽性的患兒中，男性16例，女性5例；年齡分布較集中，2歲以下20例，占陽性病例總數(shù)的95.2％；小于1歲者13例，占61.9％，僅有1例患兒的年齡大于2歲。發(fā)病季節(jié)以冬季(12月、1月、2月)為主，檢出9例；其次是夏季，春秋兩季較少見。臨床表現(xiàn)主要為咳嗽、吼喘、氣促、紫紺以及肺部濕羅音和哮鳴音。臨床診斷以下呼吸道感染為主，分別為：8例診斷為間質性肺

9、炎，4例支氣管肺炎，4例毛細支氣管炎，2例支氣管炎，2例遷延性肺炎、1例右肺肺炎。21名HBoV陽性患兒的病程大都偏長，12例病程超過10天，其中有5例超過1個月。21例HBoV PCR 陽性患兒中13例出現(xiàn)吼喘，提示HBoV可能是導致兒童喘息的病原之一。3例(14.3％)伴有呼吸道合胞病毒(RSV)感染。 4．PCR擴增產物序列測定和比較分析：選取10份NP-1基因PCR產物進行核苷酸序列測定，并在GeneBank中進行比對。

10、應用ClustalX軟件對序列進行遺傳發(fā)生進化分析顯示：10份擴增產物序列在進化上距HBoV ST1較近，而與HBoV ST2距離較遠。利用 DNAStar軟件對21份產物及HBoV ST1、ST2的核苷酸序列進行了變異分析，比較結果顯示：在核苷酸水平上，21份產物與HBoV ST1、ST2的核苷酸同源性分別為99.0％～100％、98.7％～100％，21份產物擴增片斷之間的同源性為98.5％-100％，顯示高度的同源性。在氨基酸水平