人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、前言：
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。目前研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化、支持體外造血重建的功能，還有低免疫原性和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性?，F(xiàn)已證實(shí)，體外培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs對各種免疫細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用，而且這種作用是不受MHC(majorhistocompatibility comple

2、x)限制的。低免疫原性在同種異體移植中具有重要意義，而免疫調(diào)節(jié)作用，則為免疫排斥反應(yīng)的治療帶來了新的希望。有研究表明，將MSCs與異基因造血干細(xì)胞(haemopoietie stem cell，HSC)共輸入，可以有效地減弱移植后的免疫排斥反應(yīng)。目前實(shí)驗(yàn)及臨床研究所用的MSCs的主要來源是骨髓。另外，MSCs也可來源于脂肪、骨、肌肉、軟骨、肺臟、韌帶等。但由于數(shù)量有限，且對供者有一定的損傷，使其研究和應(yīng)用受到限制。為此，很有必要尋找新的

3、MSCs來源。
　　近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，從胎兒出生后多作為廢物丟棄的胎盤中，可分離出一種成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，它可能含有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)相似的特性。由于胎盤來源方便，對供者無損傷，且富含間充質(zhì)，如能分離出MSCs，將提供豐富的細(xì)胞來源。而目前，關(guān)于胎盤中是否含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞以及該細(xì)胞是否具有BMSCs相似的免疫調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)的相關(guān)研究報(bào)道很少。

4、r>　　一直以來，免疫抑制藥物在免疫排斥反應(yīng)的預(yù)防及治療中起著極為重要的作用。但是由于它們的毒副作用強(qiáng)，應(yīng)用有一定的限制性。能否利用MSCs的免疫調(diào)節(jié)特性，將MSCs與免疫抑制藥物聯(lián)合應(yīng)用于免疫排斥反應(yīng)的治療，在保證治療效果的前提下減少長期應(yīng)用藥物帶來的毒副作用，是個(gè)令人感興趣的問題。但是目前此類研究的報(bào)道很少。因此，在將它們聯(lián)合應(yīng)用于患者前，我們需要了解它們之間的相互作用。
　　本實(shí)驗(yàn)嘗試從人胎盤中分離提取間充質(zhì)樣干細(xì)胞(hum

5、an placenta derivedmesenchymal-like stem cells PDMSCs)，對其細(xì)胞表型，增殖、分化等生物特性進(jìn)行初步了解。并將人胎盤MSCs與異基因T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)PHA刺激后，通過T細(xì)胞增殖的情況來測定PDMSCs對異基因T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而通過檢測T細(xì)胞在細(xì)胞周期、早期活化標(biāo)志、細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞亞群等方面的改變，來初步探討PDMSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)制。
　　我們還

6、將PDMSCs與免疫抑制藥物環(huán)孢素A(CsA)/霉酚酸(MPA)聯(lián)合，在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，通過檢測對淋巴細(xì)胞增殖情況的影響來初步判斷二者在異體免疫反應(yīng)中的相互作用。通過這些研究，我們期望能更加深入的了解胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及免疫學(xué)特性，為其在臨床上與免疫抑制藥物的聯(lián)合應(yīng)用，從而預(yù)防和治療免疫排斥反應(yīng)提供充足的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分人胎盤來源間充質(zhì)千細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性的研究
　　目的:從胎

7、盤中分離提取間充質(zhì)樣干細(xì)胞，并對其細(xì)胞表型、增殖、分化等生物特性進(jìn)行初步了解。
　　方法:組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行PDMSCs的分離及原代培養(yǎng)，傳代后進(jìn)行形態(tài)觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制PDMSCs的生長曲線，流式細(xì)胞技術(shù)檢測PDMSCs表型。PDMSCs向軟骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)，光鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)，并用甲苯胺藍(lán)染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后糖胺多糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)后vWF的蛋白表達(dá)情

8、況。
　　結(jié)果:胎盤小塊培養(yǎng)14d后有少量長梭形細(xì)胞爬出，約25d鋪滿培養(yǎng)皿70-80％，細(xì)胞呈漩渦狀生長，胞體細(xì)長似成纖維細(xì)胞。傳代后增殖速度明顯加快，約6d可鋪滿培養(yǎng)皿底80％，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)均一，連續(xù)15代后，細(xì)胞仍能維持增殖能力和典型的成纖維樣形態(tài)學(xué)特征。傳代細(xì)胞經(jīng)過約48h潛伏期后，進(jìn)入一個(gè)3-5天的對數(shù)生長期，隨后是一個(gè)較長的緩慢增長期。平均倍增時(shí)間約為38h。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測PDMSCs均一表達(dá)CD29，CD44

9、，而不表達(dá)CD31，CD34,CD45，HLA-DR。PDMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)7d后，由梭形逐漸向多角形多邊形轉(zhuǎn)變，并有多處凸起，誘導(dǎo)14d后，甲苯胺藍(lán)染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性。PDMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)4d后，少量細(xì)胞核呈橢圓形，胞體變小呈卵圓形，形態(tài)飽滿，立體感強(qiáng)。第8d-12d，細(xì)胞60％-90％匯合，胞體變小呈鵝卵石樣。細(xì)胞首尾緊密連接，呈管腔狀、輪輻狀、條帶狀生長。誘導(dǎo)后4d胞漿和胞核開始表達(dá)vWF。
　　結(jié)論:

10、本研究成功地從人胎盤組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞PDMSCs，并證明PDMSCs有較強(qiáng)的增殖能力，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表型，并可在一定條件下誘導(dǎo)表達(dá)軟骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志，提示PDMSCs有多向分化潛能。
　　第二部分人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對異基因T淋巴細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的探討
　　目的:研究PDMSCs對共培養(yǎng)后異基因T淋巴細(xì)胞的影響，探討PDMSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的方式及可能機(jī)制。
　　方

11、法:將PDMSCs與PHA激活的外周血T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，MTT法檢測T細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞的周期，早期活化標(biāo)志CD25、CD69的表達(dá)情況，AnnexinⅤ法檢測T淋巴細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測T細(xì)胞分泌IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-4的水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞中CD4+CD25+細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果:PDMSCs對PHA激活的外周血T淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，但對其凋亡無影響?？稍黾覶細(xì)胞中G0/G1

12、期細(xì)胞數(shù)量的比例，下調(diào)早期活化標(biāo)志CD25、CD69的表達(dá)，增加T細(xì)胞分泌IL-10，IL-4的水平，降低T細(xì)胞分泌IFN-γ，IL-2的水平，上調(diào)CD4+CD25+T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中的比例。
　　結(jié)論:PDMSCs在體外可抑制PHA刺激的T細(xì)胞的增殖，改變T細(xì)胞周期，抑制早期活化，改變T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的分泌是其可能機(jī)制。PDMSCs具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，在移植免疫的預(yù)防及治療中可能具有重要意義。
　　第三部分人胎盤間充

13、質(zhì)干細(xì)胞與免疫抑制藥物在單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)中的相互作用
　　目的:將PDMSCs與免疫抑制藥物聯(lián)合在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，來檢測它們在異體免疫反應(yīng)中的相互作用。
　　方法:PDMSCs單獨(dú)或與免疫抑制藥物（環(huán)孢素A/霉酚酸）同時(shí)在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，MTT法檢測T細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:PDMSCs單獨(dú)在體外作用于單向淋巴細(xì)胞混合實(shí)驗(yàn)，可抑制反應(yīng)中T細(xì)胞的增殖，且呈細(xì)胞數(shù)量依賴性。與環(huán)孢素A