HTLV-1病毒Tax蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞HMGB1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分不同T淋巴細(xì)胞中人HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平
　　目的:觀察HTLV-1+、Tax+和Tax-T淋巴細(xì)胞人HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,分析Tax蛋白是否影響HMGB1的表達(dá)。
　　方法:從Tax-T細(xì)胞(Jurkat和TaxN)、Tax+T細(xì)胞(TaxP)、HTLV-1+T細(xì)胞(MT-4、MT-2)提取總RNA和蛋白質(zhì),以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-Tax表達(dá)載體及其突變型Tax M22、Tax M47至

2、Jurkat細(xì)胞,24h后提取總RNA和蛋白質(zhì)。然后通過逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR定量檢測HMGB1 mRNA表達(dá)水平,分析Tax蛋白對(duì)HMGB1 mRNA表達(dá)的影響;通過免疫印跡檢測HMGB1蛋白表達(dá)水平,分析Tax及其突變蛋白對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:Tax+T細(xì)胞(TaxP)中HMGB1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯高于Tax-T細(xì)胞(Jurkat、TaxN)。HTLV-1+T細(xì)胞(MT-2、MT-4)中的HMGB1 m

3、RNA表達(dá)水平略微低于HTLV-1-T細(xì)胞(TaxP、Jurkat),而HTLV-1-T細(xì)胞(Jurkat)和HTLV-1+T細(xì)胞(MT-2、MT-4)間HMGB1蛋白未表現(xiàn)出明顯的差異。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Tax及其突變型M22和M47至Jurkat細(xì)胞中,Tax及其M22、M47突變蛋白促進(jìn)HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:HTLV-1病毒Tax蛋白可能與某種轉(zhuǎn)錄因子相互作用促進(jìn)人HMGB1基因的表達(dá),而HTLV-1病毒的其他

4、蛋白可能抑制HMGB1基因表達(dá)。了解不同T淋巴細(xì)胞中HMGB1基因表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究Tax蛋白如何影響人HMGB1基因調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分不同HMGB1熒光素酶報(bào)告基因及其Jurkat穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建不同高遷移率族蛋白B1(HMGB1)調(diào)控序列的熒光素酶報(bào)告基因及其穩(wěn)定表達(dá)的Jurkat細(xì)胞株,為研究Tax蛋白影響HMGB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供質(zhì)粒及細(xì)胞來源。
　　方法:設(shè)計(jì)多個(gè)3’-端固定的H

5、MGB1調(diào)控引物,以Jurkat細(xì)胞基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增不同長度HMGB1調(diào)控基因(-83~+83、-383~+83、-688~+83、-975~+83、-1163~+83、-1327~+83、-1520~+83),均將其連入pMD18-T載體,并轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a,氨芐青霉素篩選,陽性克隆并提取質(zhì)粒,經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定和DNA測序驗(yàn)證,正確的陽性克隆經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ雙酶切后,連入p

6、GL3-neo-luc報(bào)告基因的KpnⅠ/HindⅢ位點(diǎn)之間,成功構(gòu)建含不同HMGB1調(diào)控基因的熒光素酶報(bào)告基因pGL3-HMGB1-luc質(zhì)粒。同樣,-1520~+83HMGB1調(diào)控基因經(jīng)XhoⅠ/HindⅢ雙酶切后,連入pGL3-neo-luc報(bào)告基因的XhoⅠ/HindⅢ位點(diǎn)之間,又構(gòu)建出含-504~+83HMGB1的pGL3-HMGB1-luc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染不同pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc報(bào)告基因質(zhì)粒至Ju

7、rkat細(xì)胞,48h后加入終濃度600μg/ml的G418進(jìn)行藥物加壓篩選20d,然后選取單個(gè)陽性克隆細(xì)胞,用300μg/ml繼續(xù)篩選2~3個(gè)月,熒光素酶活性驗(yàn)證是否成功構(gòu)建其穩(wěn)定表達(dá)的Jurkat細(xì)胞株。
　　結(jié)果:以Jurkat細(xì)胞基因組為模板,克隆擴(kuò)增7個(gè)3’-端固定的HMGB1調(diào)控基因,成功構(gòu)建了8種pGL3-HMGB1-luc報(bào)告基因,按HMGB1基因由短至長順序依次命名為pHLuc1~pHLuc8。轉(zhuǎn)染pHLuc1~p

8、HLuc8報(bào)告基因和pGL3-neo-luc至Jurkat細(xì)胞,經(jīng)G418藥物篩選,成功構(gòu)建含有pHLuc1~pHLuc8或pGL3-neo-luc報(bào)告基因的Jurkat穩(wěn)定細(xì)胞株,并根據(jù)HMGB1調(diào)控基因有無及其由短至長順序,依次命名為HJ1~HJ8細(xì)胞和NEO細(xì)胞。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建HMGB1熒光素酶報(bào)告基因及其HJ穩(wěn)定細(xì)胞株,為找尋HMGB1啟動(dòng)子區(qū)域,研究Tax蛋白影響HMGB1基因的調(diào)控機(jī)制和HMGB1在成人T淋巴細(xì)胞

9、白血病中的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分HTLV-1病毒Tax蛋白對(duì)人T淋巴細(xì)胞HMGB1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響
　　目的:觀察不同T淋巴細(xì)胞中人HMGB1基因啟動(dòng)子活性,探討Tax及其M22、M47突變蛋白對(duì)HMGB1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。
　　方法:不同pGL3-HMGB1-luc報(bào)告基因和pGL3-neo-luc(對(duì)照)同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到THP1、Hela、Jurkat、TaxP、TaxN、MT-4、MT-2等不同種類細(xì)

10、胞中,以及不同pGL3-HMGB1-luc報(bào)告基因與pCMV-Tax或其突變型M22、M47(pCMV-Neo作為對(duì)照)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到Jurkat細(xì)胞中,24h后檢測熒光素酶活性,觀察不同細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性比率(HMGB1/neo)和Tax及其M22、M47突變蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞中HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況(Tax/Neo)。Tax及其突變型TaxM22、TaxM47瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HJ穩(wěn)定細(xì)胞株(HJ1~HJ8),pCMV-Neo質(zhì)粒作為

11、對(duì)照,比較不同HJ細(xì)胞株中HMGB1的相對(duì)熒光素酶活性(Tax/Neo)。通過細(xì)胞接觸逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法,HTLV-1+的MT-2細(xì)胞(Hut-78細(xì)胞作為對(duì)照)分別與HJ穩(wěn)定細(xì)胞株(HJ1~HJ8)以1:4的比例進(jìn)行共培養(yǎng),比較每種細(xì)胞株中HMGB1的相對(duì)熒光素酶活性[(MT-2)/(Hut-78)]。比較Tax蛋白對(duì)瞬時(shí)表達(dá)HMGB1基因和穩(wěn)定表達(dá)HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異。觀察BAY11-7082/NF-κB抑制劑對(duì)Tax蛋白誘導(dǎo)

12、HMGB1基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　結(jié)果:HMGB1在不同種類細(xì)胞中的調(diào)控趨勢(shì)大致相似,均表現(xiàn)出587bp長度HMGB1(-504~+83)的啟動(dòng)子活性最高。HTLV-1+T細(xì)胞(MT-4、MT-2)中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性略低于HTLV-1-T細(xì)胞(Jurkat、TaxP)。比較TaxN(Tax-)和TaxP(Tax+)細(xì)胞中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)現(xiàn),Tax蛋白促進(jìn)pHLuc6~pHLuc8質(zhì)粒中HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。不同pGL3-H

13、MGB1-luc報(bào)告基因與pCMV-Tax共轉(zhuǎn)染到Jurkat細(xì)胞也顯示,Tax蛋白對(duì)-975~+83HMGB1基因影響不明顯,但促進(jìn)pHLuc6~pHLuc8報(bào)告基因中HMGB1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。隨著Tax劑量的增加,pHLuc6質(zhì)粒中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)。Tax及其突變型Tax M22、Tax M47與pHLuc3或pHLuc6共轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞發(fā)現(xiàn),Tax及其M22、M47突變蛋白對(duì)pHLuc3質(zhì)粒中HMGB1轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響

14、不明顯,而促進(jìn)pHLuc6質(zhì)粒中HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。BAY11-7082/NF-κB抑制劑不影響Tax蛋白調(diào)控HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論:-504~-383可能是HMGB1轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū),Tax蛋白可能結(jié)合在HMGB1的-1163~-975區(qū)段誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄,但不是通過NF-κB途徑進(jìn)行的。
　　第四部分富集Tax蛋白的HMGB1基因生物信息學(xué)分析及Tax蛋白對(duì)其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究
　　目的:探討Tax

15、蛋白影響人T淋巴細(xì)胞HMGB1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因片段、順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子。
　　方法:TaxP細(xì)胞經(jīng)固定、超聲和染色體免疫共沉淀(ChIP)處理后獲得純化的DNA,通過特異性引物,實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增中心位點(diǎn)于-1103和-797處的HMGB1基因,尋找Tax蛋白富集在HMGB1的基因部位。應(yīng)用生物信息學(xué)初步分析HMGB1-1163~-975區(qū)段的反式作用因子結(jié)合位點(diǎn),通過野生型pHLuc6分別對(duì)其順式作用元件實(shí)施缺失突變,構(gòu)建不同

16、突變型pHLuc6報(bào)告基因。在Jurkat中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染pCMV-Tax和突變型pHLuc6(野生型pHLuc6作為對(duì)照),或pCMV-Tax(pCMV-Neo作為對(duì)照)和突變型pHLuc6,24h后檢測熒光素酶活性,比較Tax蛋白對(duì)野生型和突變型pHLuc6中HMGB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異,尋找Tax蛋白影響人T淋巴細(xì)胞HMGB1基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。
　　結(jié)果:ChIP純化后的樣本經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增后,我們發(fā)現(xiàn)Tax蛋白在HMGB

17、1-1103基因(-1163~-1043)的富集信號(hào)明顯強(qiáng)于-797基因(-848~-746)的信號(hào)。即Tax蛋白主要富集在HMGB1的-1163~-975區(qū)段。生物信息學(xué)分析獲知,HMGB1-1163~-975區(qū)段有6種反式作用因子(AML-1a、AP-1、CdxA、USF、v-Myb和C/EBP)。使用野生型pHLuc6,分別針對(duì)每種轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件進(jìn)行缺失突變,重新成功構(gòu)建分別針對(duì)上述6種轉(zhuǎn)錄因子的突變型pHLuc6,依次命

18、名為mLuc6-AM、mLuc6-AP、mLuc6-Cd、mLuc6-U、mLuc6-M、mLuc6-C。瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染pCMV-Tax和野生型pHLuc6或其突變型pHLuc6至Jurkat細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)突變型mLuc6-C中HMGB1的轉(zhuǎn)錄活性低至野生型pHLuc6的52％,并且在Jurkat細(xì)胞中Tax蛋白不影響mLuc6-C中HMGB1基因的調(diào)控表達(dá)。
　　結(jié)論:Tax蛋白富集在HMGB1的-1163~-975區(qū)段,可能通過轉(zhuǎn)錄