HTLV-1 HBZ對(duì)cyclin D1表達(dá)的調(diào)控作用和HTLV-1 ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、背景與目的:
　　人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒（human T-lymphotropic virus，HTLV）是最早發(fā)現(xiàn)的人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，主要包括四種亞型，其中HTLV-1和HTLV-2二者的基因水平70％同源。成人T細(xì)胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)和HTLV-1相關(guān)性脊髓病/熱帶痙攣性下肢輕癱(HTLV-1 assoeiated myelopathy/Tropical SPastioparapare

2、sis，HAM/TSP)是主要的HTLV-1感染相關(guān)性疾病。HTLV-1和HTLV-2可通過垂直途徑，性接觸和腸道外途徑（血液傳播和靜脈用藥）進(jìn)行傳播，在全球均有流行。HTLV-1主要流行于日本、加勒比地區(qū)，中美洲和南美洲及中非西非等地區(qū)。HTLV-2流行主要是印第安人群和某些中非部落，以及歐洲和北美的某些特定人群。我國屬于HTLV非流行區(qū)，自1985年來開展過幾次HTLV流行調(diào)查，感染率為0.06％-1.27％，流行區(qū)域主要分布于東南

3、沿海地區(qū)。但對(duì)于人口大省的河南和湖北，對(duì)HTLV感染及流行的研究報(bào)道較少。由于不同地域的病毒株之間存在差異，目前的HTLV-1檢測(cè)方法均存在一定的假陽性或假陰性問題。
　　HBZ是近年來在HTLV-1感染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種由基因組負(fù)鏈或互補(bǔ)鏈編碼產(chǎn)生的病毒蛋白，在大部分ATL細(xì)胞中成陽性表達(dá)，可以抑制Tax介導(dǎo)的病毒基因表達(dá)。HBZ還能通過它的bZIP結(jié)構(gòu)域，與宿主的多種bZIP因子相互作用，從而改變下游基因轉(zhuǎn)錄活性，被認(rèn)為在HTL

4、V-1致病機(jī)制上起著重要作用。但HBZ在HTLV-1感染細(xì)胞中的致瘤作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。
　　本研究以HBZ病毒蛋白為對(duì)象，研究HBZ對(duì)293T細(xì)胞周期蛋白cyclin D1表達(dá)的影響，并以HBZ為基礎(chǔ)，初步建立了HTLV-1的ELISA檢測(cè)方法，最后，對(duì)華中地區(qū)不同人群中的HTLV1/2感染情況作了流行病學(xué)調(diào)查。為了解HBZ在細(xì)胞周期進(jìn)程中的作用機(jī)制，改進(jìn)HTLV-1篩查方法，以及了解河南湖北兩省HTLV感染流行狀況，提供了

5、一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　第一部分 HBZ通過與轉(zhuǎn)錄因子CREB相互作用抑制cyclin D1表達(dá)
　　方法:
　　1.擴(kuò)增全長HBZ、HBZ-AD以及HBZ-bZIP三個(gè)片段，分別克隆入慢病毒載體LV5，包裝純化重組慢病毒;分別將三個(gè)慢病毒感染293T細(xì)胞，CEM細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)HBZ三個(gè)片段的細(xì)胞系。
　　2.RT-PCR和Western Blot檢測(cè)293T-HBZ細(xì)胞、CEM-H

6、BZ細(xì)胞及Jurkat-HBZ細(xì)胞中cyclin D1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。
　　3.構(gòu)建cyclin D1啟動(dòng)子全長及包含不同轉(zhuǎn)錄因子區(qū)域的五個(gè)報(bào)告基因載體，檢測(cè)表達(dá)不同HBZ片段的細(xì)胞中cyclin D1啟動(dòng)子的活性狀況。
　　4.提取空白293T細(xì)胞及293T-HBZ細(xì)胞總蛋白，利用anti-HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀(ColP)，再利用anti-CREB抗體通過Western Blot檢測(cè)HBZ與CREB間在體內(nèi)的

7、相互關(guān)系。
　　5.構(gòu)建CREB的原核表達(dá)載體pGEX-2T-CREB，利用誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得的融合蛋白GST-CREB與HBZ進(jìn)行GST pull-down，檢測(cè)HBZ與CREB間在體外的相互關(guān)系。
　　6.構(gòu)建HBZ-bZIP的原核表達(dá)載體pGEX-2T-HBZ-bZIP，利用誘導(dǎo)純化的GST-HBZ-bZIP融合蛋白進(jìn)行GST pull-down，檢測(cè)HBZ-bZIP和HBZ-AD與CREB間在體外的相互關(guān)系。

8、>　　結(jié)果:
　　1.HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP三個(gè)重組慢病毒載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確;三個(gè)重組慢病毒感染、篩選得到穩(wěn)定表達(dá)HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP的細(xì)胞株。
　　2.RT-PCR和Western Blot結(jié)果均顯示，與空白293T細(xì)胞相比，293T-HBZ細(xì)胞和293T-HBZ-bZIP細(xì)胞中cyclin D1基因表達(dá)水平顯著降低。說明HBZ的bZIP結(jié)構(gòu)域可以降低細(xì)胞中cyclin D1轉(zhuǎn)錄和表

9、達(dá)水平。
　　3.將cyclin D1全長啟動(dòng)子報(bào)告基因載體pGL3-CD1轉(zhuǎn)染空白CEM細(xì)胞、CEM-HBZ細(xì)胞、CEM-HBZ-AD細(xì)胞及CEM-HBZ-bZIP細(xì)胞后，表達(dá)HBZ和HBZ-bZIP的細(xì)胞中cyclin D1啟動(dòng)子活性降低。當(dāng)報(bào)告基因載體中啟動(dòng)子片段長度包含CRE位點(diǎn)時(shí)（CD2和CD3），細(xì)胞中啟動(dòng)子活性無明顯下降;而當(dāng)刪除CRE位點(diǎn)后(CD4)，空白細(xì)胞和HBZ-AD細(xì)胞中啟動(dòng)子活性下降約50％，說明CRE位

10、點(diǎn)是cyclin D1啟動(dòng)子上的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。
　　4.CoIP結(jié)果顯示，利用anti-HA抗體對(duì)293T-HBZ細(xì)胞總蛋白進(jìn)行沉淀獲得的復(fù)合物中，可以檢測(cè)到CREB;利用GST-CREB融合蛋白進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明CREB和HBZ蛋白在體外可以直接結(jié)合。
　　5.進(jìn)一步GST pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GST-CREB融合蛋白可以與HBZ-bZIP相互結(jié)合，而GST-HBZ-bZIP融合蛋白

11、也可以與CREB相互結(jié)合;GST-CREB融合蛋白可以與HBZ相互結(jié)合，但不與HBZ-AD相互結(jié)合。
　　第二部分以HBZ為抗原的HTLV-1 ELISA檢測(cè)方法的初步建立
　　方法:
　　1.PCR擴(kuò)增HBZ目的基因，克隆入T載體，酶切鑒定后，亞克隆入原核表達(dá)載體pET-29a，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定及測(cè)序鑒定后，構(gòu)建HBZ原核表達(dá)載體。
　　2.通過IPTG誘導(dǎo)HBZ蛋白表達(dá)，并利用His標(biāo)簽通過Ni2+親和

12、層析柱純化蛋白，SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定后，對(duì)目的蛋白進(jìn)一步進(jìn)行透析純化。
　　3.以HBZ蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，以親和素標(biāo)記的HBZ蛋白為酶標(biāo)抗原，利用雙抗原夾心法檢測(cè)血清標(biāo)本中的相應(yīng)抗體，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立HTLV-1 ELISA檢測(cè)方法。
　　4.通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清、臨床血清的檢測(cè)，與其他商品試劑盒的比較，以及穩(wěn)定性檢測(cè)，對(duì)該ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　1.PCR擴(kuò)增

13、得到HBZ片段，酶切鑒定及測(cè)序鑒定證實(shí)得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-29a-HBZ。
　　2.通過IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳顯示25kD處特異性條帶;經(jīng)過Ni2+親和層析柱對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化后，SDS-PAGE電泳顯示25kD處單純條帶;Western Blot結(jié)果顯示純化后的HBZ蛋白具有良好的抗原性。
　　3.純化HBZ蛋白標(biāo)記生物素后，經(jīng)親和素鑒定酶標(biāo)抗原活性良好;確定使用30μl標(biāo)本，并采用“三步法”的反應(yīng)模

14、式檢測(cè)40min，可獲得較好的檢測(cè)效果。
　　4.對(duì)參比血清的檢測(cè)結(jié)果顯示該ELISA方法具有較好的檢測(cè)效果;穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果顯示該ELISA檢測(cè)試劑具有較好的穩(wěn)定性;對(duì)臨床血清標(biāo)本的檢測(cè)，及與國內(nèi)外商品試劑進(jìn)行比較的結(jié)果顯示，該檢測(cè)法靈敏度和特異性分別為71.6％，96.7％，Kappa值為0.54，有較好的一致性。
　　第三部分華中地區(qū)不同人群中的HTLV-1/2流行病學(xué)調(diào)查
　　方法:
　　1.收集2008年

15、-2011年間，河南湖北兩省血清標(biāo)本5480份，包括獻(xiàn)血人群(3548份)，血液腫瘤患者（908份）和高危人群（1024份）三組。利用北京萬泰的HTLV檢測(cè)試劑盒對(duì)標(biāo)本進(jìn)行初步篩查，陽性標(biāo)本再進(jìn)一步通過Western Blot確證HTLV-1或HTLV-2感染情況。
　　2.對(duì)感染狀況及高危因素進(jìn)行單因素方差分析及多元邏輯回歸分析。
　　3.對(duì)經(jīng)Western Blot證實(shí)的HTLV-1陽性標(biāo)本提取前病毒基因組，對(duì)全長基因組

16、序列進(jìn)行分段擴(kuò)增，與T載體連接后送測(cè)序，利用生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接;對(duì)HTLV-1前病毒基因組序列進(jìn)行分析，并利用進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析。
　　結(jié)果:
　　1.ELISA檢出17例HTLV-1/2抗體陽性標(biāo)本，經(jīng)過Western Blot證實(shí)，HTLV-1抗體陽性7例，HTLV-2抗體陽性3例。
　　2.HTLV-1和HTLV-2間感染率無差異，但高危人群組較獻(xiàn)血源組HTLV-1感染率增加（P=0.03）;HTLV-1

17、與HIV、HBV、HCV合并感染較常見(P＜0.05)。HTLV-1感染流行與HIV及HBV相關(guān)（P=0.006，P=0.000）。
　　3.經(jīng)過測(cè)序和拼接獲得HTLV-1全病毒基因組序列(KC807984);該序列長度為9034bp，屬Genotype A，與其他中國病毒株親緣關(guān)系最密切，與日本病毒株及加拿大病毒株親緣較近。
　　結(jié)論:
　　1.HBZ可以通過其bZIP結(jié)構(gòu)域，與轉(zhuǎn)錄因子CREB相互作用，影響CREB

18、與cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)域的CRE位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致293T細(xì)胞中cyclin D1表達(dá)水平降低，為HBZ在細(xì)胞周期變化中的作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
　　2.初步建立了以HBZ為抗原的HTLV-1 ELISA檢測(cè)方法。
　　3.流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)不同人群中存在HTLV-1/2感染病例，無償獻(xiàn)血人群及血液腫瘤患者中感染率低，高危人群組中HTLV-1/2感染率相對(duì)較高，HIV和HBV感染是HTLV-