基于改進(jìn)的高通量酵母雙雜交技術(shù)平臺(tái)研究人類肝臟重要蛋白質(zhì)的相互作用.pdf

1、肝臟是人體最大的代謝器官，在人體中具有不可替代的重要生理功能。研究肝臟內(nèi)重要蛋白質(zhì)的相互作用是理解肝臟生理功能與分子機(jī)制的基礎(chǔ)。本論文利用改進(jìn)的高通量酵母雙雜交技術(shù)平臺(tái)來(lái)研究人肝臟重要蛋白質(zhì)的相互作用，為初步描繪人類肝臟重要蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖打下了一定的基礎(chǔ)。其內(nèi)容主要有以下幾個(gè)方面：(1)酵母雙雜交誘餌載體pDBlg的構(gòu)建：最初的雙雜交系統(tǒng)是invitrogen公司的PROQUSTTMTwo-hybridsystem，在此將其誘餌載

2、pDBLeu載體作出了改進(jìn)：在其多克隆位點(diǎn)處引入兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)不一樣的Bsu36I酶切位點(diǎn)(利用Bsu36I識(shí)別位點(diǎn)中有可變堿基)，兩個(gè)Bsu36I酶切位點(diǎn)之間插入一個(gè)帶有強(qiáng)啟動(dòng)子Prrn的GFP作為反選擇標(biāo)記。所有感興趣的肝臟ORF經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后(引物兩端加上TTAC與TGAC接頭)，經(jīng)過(guò)T4DNApolymerase處理后直接和經(jīng)Bsu36I酶切的載體相連。 (2)利用生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取了與代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化應(yīng)激、信

3、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期調(diào)控等相關(guān)的肝臟基因430個(gè)，用PCR方法擴(kuò)增這430個(gè)基因，PCR產(chǎn)物與pDBlg相連接，并測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒。 (3)430個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Mav203后，將430個(gè)mav203(pDB-x)進(jìn)行自激活驗(yàn)證后，利用改進(jìn)的雙雜交系統(tǒng)，篩選人類肝臟cDNA文庫(kù)，對(duì)于篩選到的陽(yáng)性克隆經(jīng)質(zhì)粒拯救、測(cè)序、Blast分析后共得到蛋白質(zhì)相互作用對(duì)471對(duì)，再次回溯到酵母體內(nèi)驗(yàn)證，其陽(yáng)性率約為60﹪。 (4