酵母雙雜交技術(shù)篩選與SOX4相互作用的蛋白質(zhì)及其功能研究.pdf

1、SOX4是SOX[SRY(Sex-relatedregionY)-box]轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員，在胚胎發(fā)育過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。SOX4選擇性表達(dá)于動(dòng)物卵巢，睪丸，胸腺以及T，前B淋巴細(xì)胞中。近年來越來越多的研究表明，SOX4在許多腫瘤組織中高表達(dá)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、成髓細(xì)胞瘤以及肝癌等，提示SOX4可能與腫瘤形成有關(guān)。另有研究顯示，SOX4在前列腺素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中表達(dá)增加，提示它可能參與了凋亡調(diào)控。SOX4參與了許多生理

2、及病理過程的調(diào)控，但它發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚。為了進(jìn)一步揭示SOX4重要生物學(xué)功能，我們應(yīng)用酵母雙雜交篩選技術(shù)對(duì)SOX4相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行了篩選并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。 我們分別以SOX4的兩個(gè)片斷SOX4(aa1-133)和SOX4(aa130-380)分別作為誘餌，從人乳腺文庫(kù)中篩選與其相互作用的蛋白質(zhì)。我們從203個(gè)候選克隆中篩選出4個(gè)陽(yáng)性克隆與SOX4存在相互作用。測(cè)序結(jié)果表明，這4個(gè)克隆為同一基因來源：Ubc9(Ub

3、iquitin-conjugatingenzyme9)。隨后我們從人乳腺文庫(kù)中釣取了其cDNA序列，為下一步的結(jié)構(gòu)和功能研究做好準(zhǔn)備。SOX4與Ubc9之間的相互作用隨后通過體外的GSTpull-down實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。除此之外，我們還應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的熒光蛋白共定位技術(shù)，在活細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了SOX4和Ubc9共定位于細(xì)胞核里。更進(jìn)一步，通過構(gòu)建不同SOX4缺失突變體和Ubc9共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SOX4的DNA結(jié)

4、合結(jié)構(gòu)域HMG-box是它與Ubc9結(jié)合區(qū)域。 為確定SOX4和Ubc9相互作用的生物學(xué)意義，我們?cè)谡婧思?xì)胞中建立了一套SOX4和p53轉(zhuǎn)錄激活熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)。測(cè)活結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在293T細(xì)胞中Ubc9可以特異地抑制SOX4轉(zhuǎn)錄活性，而對(duì)與SOX4同亞族的SOX11無抑制作用。Ubc9第93位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸后，這種活性抑制作用依然存在，提示Ubc9對(duì)SOX4轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用不依賴于它的SUMO化E2酶活性。同時(shí)，在乳腺

5、癌T47D細(xì)胞中進(jìn)行的內(nèi)源SOX4活性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，Ubc9能作為轉(zhuǎn)錄共抑制子，抑制孕激素誘導(dǎo)的SOX4轉(zhuǎn)錄活性。在H1299細(xì)胞中，我們首次發(fā)現(xiàn)SOX4在一定劑量范圍內(nèi)能增強(qiáng)p53轉(zhuǎn)錄活性，并且這種作用呈一定劑量依賴性。另外Ubc9本身不能直接調(diào)節(jié)p53的活性，但能逆轉(zhuǎn)SOX4增強(qiáng)p53轉(zhuǎn)錄活性的效應(yīng)，提示Ubc9可能通過結(jié)合并抑制SOX4的轉(zhuǎn)錄活性而間接抑制p53活性。 總之，我們的實(shí)驗(yàn)表明，Ubc9能夠通過結(jié)合SOX4的DN