膽囊癌的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及AnnexinA3-miRNA對(duì)膽囊癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、第一部分膽囊癌患者血清及正常人血清的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 目的：應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究膽囊癌患者及正常人血清之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，篩選膽囊癌血清標(biāo)志物以及可能與膽囊癌發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)。方法：利用雙向凝膠電泳(2-DE)對(duì)6例膽囊癌患者及6例正常人血清的總蛋白進(jìn)行分離，并用質(zhì)譜儀對(duì)兩組間差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行肽指紋譜和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。利用蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組化法檢測(cè)差異蛋白在膽囊癌患者和健康人血清及組織的表達(dá)。結(jié)果：共有24個(gè)蛋白點(diǎn)

2、被成功鑒定。其中在膽囊癌患者血清中高表達(dá)的有12個(gè)，它們是Splicingfactor3Bsubunit5,Cystatin-B,S100A10Protein,HistoneH2Btype2-E,Profilin-1,EukaryotictranslationinitiationfactorlA,IsoformlofEukaryotictranslationinitiationfactor5A-l,FERMdomaincontainin

3、g3,haptoglobinprotein,Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,SerumamyloidP-componentprecursor,harmoninisoformb3。在膽囊癌患者血清中表達(dá)降低的有12個(gè)，分別是ApolipoproteinA-Iprecursor,Myosinregulatorylightchain2,IsoformlofProteincanopyhomolog

4、2precursor,Proteasomesubunitbetatype-2,ARHGDIA,Superoxidedismutase[Mn],IsoformlofFicolin-3precursor,zincalpha-2-glycoproteinl,HPhaptoglobinisoform2preproprotein,CD5antigen-likeprecursor,CLUclusterinisoform,ITIH471kDaprot

5、ein。Western印跡及免疫組化證實(shí)了S100A10蛋白和結(jié)合珠蛋白(haptoglobinprotein)在膽囊癌患者血清及組織中高表達(dá)。結(jié)論：以2-DE結(jié)合質(zhì)譜鑒定是血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的可靠平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)所得的S100A10等差異表達(dá)蛋白可能是潛在的診斷膽囊癌的分子標(biāo)志物或控制腫瘤生長(zhǎng)的治療靶點(diǎn)。
　　 第二部分人膽囊癌組織及膽囊良性組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 目的：應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究人膽囊癌組織和膽囊

6、良性組織之間差異表達(dá)蛋白質(zhì)。方法：利用雙向凝膠電泳(2-DE)對(duì)6例膽囊癌組織和6例膽囊良性組織的總蛋白進(jìn)行分離，并用質(zhì)譜儀對(duì)兩組間差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行肽指紋譜和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。利用蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組化法檢測(cè)差異蛋白在膽囊癌組織和膽囊良性組織的表達(dá)。結(jié)果：共有17個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定。其中在膽囊癌組織中高表達(dá)的有9個(gè)，它們是AnnexinA3,Phosphatidylethanolamine-bindingproteinl(PEBP1),A

7、CTG1protein,GAPDH,Alcoholdehydrogenase,Fructose-bisphosphatealdolase,Interferon-inducedproteinwithtetratricopeptide,acyl-CoAdehydrogenase,TTRprotein;在膽囊癌組織中表達(dá)降低的有8個(gè)，分別是Superoxidedismutase,Plasmaretinol-bindingproteinprec

8、ursor,Alpha-crystallinBchain,Hemoglobin,CathepsinDprecursor,Aldo-ketoreductasefamilylmemberB10,Tripartitemotif-containing45,Serotransferrinprecursor。Westernblot和免疫組化結(jié)果顯示差異表達(dá)蛋白AnnexinA3和Phosphatidylethanolamine-bindingpro

9、teinl(PEBP1)在膽囊癌組織中表達(dá)上調(diào)，與2-DE結(jié)果一致。結(jié)論：以2-DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是腫瘤研究的一種重要手段。本實(shí)驗(yàn)所得的AnnexinA3、PEBP1等差異表達(dá)蛋白可能成為潛在的診斷膽囊癌的分子標(biāo)志物或控制腫瘤生長(zhǎng)的治療靶點(diǎn)。
　　 第三部分AnnexinA3-miRNA對(duì)膽囊癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)的研究
　　 目的：構(gòu)建針對(duì)AnnexinA3的miRNA真核表達(dá)載體，并導(dǎo)入膽囊癌細(xì)胞，探討其對(duì)Ann

10、exinA3基因的干擾作用以及對(duì)膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。方法：人工合成AnnexinA3-miRNA的寡核苷酸鏈，將其插入到pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR載體中；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建重組體導(dǎo)入人膽囊癌細(xì)胞系SGC-996中；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-TimePCR)、免疫印跡法(Westernblot)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞AnnexinA3mRNA和蛋白的表達(dá)變化。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組SGC-996細(xì)胞的增

11、殖：用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染AmexinA3-miRNA載體的SGC-996細(xì)胞周期及凋亡；用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察各組SGC-996細(xì)胞的隨意運(yùn)動(dòng)能力的變化；利用Transwell小室測(cè)定轉(zhuǎn)染AnnexinA3-miRNA載體的SGC-996細(xì)胞的穿膜侵襲力。結(jié)果：成功構(gòu)建了AnnexinA3的miRNA真核表達(dá)載體AnnexinA3-miRNA；轉(zhuǎn)染AnnexinA3-miRNA載體后，SGC-996細(xì)胞AnnexinA3mRNA和

12、蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯下降(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組SGC-996細(xì)胞增殖較對(duì)照組明顯減慢(P<0.05)。干擾前后細(xì)胞周期無(wú)明顯差異(P>0.05)，但細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)。干擾后膽囊癌細(xì)胞遷移能力明顯下降(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基底膜的侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組(p<0.01)。結(jié)論：AnnexinA3-miRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染SGC-996細(xì)胞后獲得穩(wěn)定表達(dá)，并可特異性封閉AnnexinA3的表達(dá)。該載體