慢病毒介導的RNAi沉默HOXB13基因?qū)η傲邢侔㎜NCap細胞生物學行為影響的研究.pdf

1、目的：前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，美國前列腺癌的發(fā)病率占男性惡性腫瘤首位，2008年新發(fā)病例占25％(186，320)，年死亡率占男性惡性腫瘤相關(guān)死亡總數(shù)的9％。在我國，前列腺癌的發(fā)病率呈迅速上升趨勢。早期局限性前列腺癌一般采用手術(shù)或局部放療，晚期首選方案是通過外科手術(shù)或藥物達到去勢目的。然而，最初對內(nèi)分泌治療敏感的前列腺癌患者后期會產(chǎn)生激素抵抗，進而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。進一步深入研究前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機制非常必要。HOXB13基

2、因是同源盒基因中的一員，在胚胎發(fā)育過程和腫瘤的發(fā)生發(fā)展階段中其重要的作用，該基因在前列腺癌中的作用及功能有待進一步研究。RNAi是近年來新興的用于基因抑制的生物技術(shù)，可用于基因組研究、信號傳導等方面。本研究利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建HOXB13 shRNAi慢病毒表達載體，觀察其對前列腺癌細胞株LNCap等生物學行為作用的影響。不僅充實HOXB13基因的功能，也將在前列腺癌發(fā)病機制上有創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)。
　　 材料與方法：
　　

3、1.利用RNAi技術(shù)，設計合成針對HOXB13基因的4條siRNA，連接到雙酶切的tele-sh003質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性菌落、擴增后提取質(zhì)粒，進行DNA測序鑒定。重組慢病毒表達載體質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒(pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G)按照一定比例混合，共同轉(zhuǎn)染包裝293FT細胞，收集、濃縮清液，得到病毒顆粒，用real-time PCR方法計算病毒顆粒的滴度。
　　 2、試驗分HO

4、XB13 RNAi感染組、HOXB3-neg組(空干擾組)和空白對照組。細胞計數(shù)法和MTT法檢測細胞生長情況，Trnaswell法檢測LNcap細胞遷移能力變化。
　　 3.經(jīng)直腸超聲引導下穿刺活檢，收集前列腺癌組織及癌旁組織，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，實時定量PCR法檢測前列腺癌及癌旁組織中HOXB13基因的表達；分析HOXB13基因與患者的生存PSA表達的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.根據(jù)人HOXB

5、13基因序列，選擇4個靶點，設計合成了4條寡核苷酸模板，成功構(gòu)建了4條HOXB13-shRNA慢病毒載體質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定插入片段序列與預期序列一致。293FT細胞包裝構(gòu)建成功重組質(zhì)粒載體，生產(chǎn)出慢病毒顆粒，并進行濃縮。
　　 2.將HOXB3-shRNA轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞株LNCap，發(fā)現(xiàn)LNCap蛋白質(zhì)表達顯著降低，表明采用的干擾片段有效。HOXB13沉默使前列腺LNCap細胞的生長加快和遷移細胞數(shù)目增加。
　　 3.H