D-serine在匹羅卡品致癇小鼠腦GABA能神經元變性中的作用研究.pdf

1、癲癇是一種嚴重的神經系統(tǒng)疾病，其特點是自發(fā)的反復發(fā)作以及腦內神經元丟失。但其發(fā)病的神經化學基礎或機制仍不清楚。以往的研究提示，顳葉癲癇的特點是病人腦內神經元丟失，反復發(fā)作，常常有認知功能障礙以及大多數顳葉癲癇病人對現有的抗癲癇藥物或其他抗癲癇治療方法不敏感。越來越多的研究表明，NMDA受體在中樞神經系統(tǒng)中對于神經元的存活、突觸的可塑性以及興奮性突觸傳遞中具有重要作用，同時NMDA受體可能參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)展，一些NMDA受體拮抗劑也顯

2、示具有抗癲癇效應。然而，由于NMDA受體拮抗劑直接的和廣泛的功能性阻斷NMDA受體所導致的嚴重的不良反應限制了NMDA受體拮抗劑在臨床的應用。因此闡明NMDA受體相關的神經化學遞質的機制對于臨床慢性癲癇的藥物治療方案的選擇非常必要。
　　D-serine分子是一種D-氨基酸即右旋一絲氨酸，在中樞神經系統(tǒng)神經元NMDA信號傳遞的調節(jié)中具有重要作用。D-serine與NMDA受體的甘氨酸位點相結合，在NMDA受體激活中充當NMDA受體

3、的內源性配體的角色。而且內源性D-serine的釋放在興奮性毒性導致的大腦皮質和海馬的神經元傷中具有重要作用，因此D-serine參與了一些神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生。精神分裂癥的病人大腦中絲氨酸消旋酶表達的變化也表明D-serine信號與其疾病的發(fā)展有關。我們猜想D-serine信號途徑可能通過NMDA受體的過度活化、興奮性毒性和神經元損傷參與慢性癲癇的發(fā)病和慢性癲癇的反復癲癇發(fā)作。在我們的前期研究中，已經明確了小鼠匹羅卡品模型中大量的神經元

4、死亡的時程變化特點；而且已證實連續(xù)腹腔注射擬膽堿劑匹羅卡品可以誘導癲癇發(fā)作、神經元丟失和自發(fā)的反復癲癇發(fā)作，上述特點與人類的顳葉癲癇十分相似。因此，本課題采用小鼠匹羅卡品模型，免疫組織化學染色檢測腦內D-serine的細胞內定位和D-serine陽性細胞的時空變化特點，D-serine與特異性標記變性神經元的Fluoro-JadeC染色、神經元的標記物NeuN、GABA能神經元的標記物GAD-67和星形膠質細胞的標記物GFAP進行雙標記

5、等方法，以闡明D-serine信號可能參與慢性癲癇的神經元死亡和慢性癲癇發(fā)病。
　　主要結果如下：
　　1．癲癇發(fā)作12-24h后在大腦皮質、海馬、杏仁核和丘腦觀察到大量D-serine陽性細胞。它們分布于細胞的胞漿、胞膜上，陽性細胞呈橢圓形，平均直徑為24±6um。癲癇發(fā)作后3天的海馬切片觀察顯示，96％的D-serine陽性細胞為NeuN陽性。
　　2．免疫熒光雙標記和激光共聚焦顯微鏡顯示，對照組沒有D-serin

6、e陽性神經元。但是，在對照組和匹羅卡品模型組同時檢測到了星形膠質細胞陽性的D-serine陽性細胞。D-serine陽性細胞在星形膠質細胞的細胞體和突起都有分布。這些D-serine陽性的星形膠質細胞在大腦皮質和海馬上廣泛分布，它們的數目和密度在匹羅卡品模型中顯著提高。
　　3．D-serine陽性神經元分布在大腦的運動皮質、軀體感覺皮質、額眶部皮質、梨狀皮質、扣帶回皮質、島葉皮質、內嗅皮質和海馬的CA1、CA2、CA3和齒狀回。

7、此外，丘腦背側也可以觀察到陽性神經元，外側丘腦下部也能觀察到少許陽性神經元，但是腦干幾乎沒有檢測到陽性產物。而且D-serine陽性神經元的數目在癲癇發(fā)作th到14d的范圍內是隨時間變化的。th時沒有檢測到陽性神經元，4h時D-serine陽性神經元開始在腦的一些區(qū)域出現，大多數區(qū)域在12-24h時逐漸升高并達到高峰，3-14d時逐漸下降。
　　4．D-serine/GAD-67的雙標記神經元主要分布在大腦皮質的錐體層和海馬的多形

8、細胞層，98％的D-serine陽性細胞為GAD-67陽性，D-serine/GAD-67的雙標記神經元占了GAD-67陽性細胞總數的34％，說明小鼠匹羅卡品模型中大多數D-serine陽性細胞為GABA能神經元。
　　5．D-serine/FJC雙標記神經元多數分布在大腦皮質的錐體層和海馬的多形細胞層。93％D-serine陽性神經元為FJC陽性，說明小鼠匹羅卡品模型中D-serine陽性神經元大多數發(fā)生了變性死亡。
　　

9、6．pNMDARl的免疫組織化學染色用來檢測NMDA受體的磷酸化，它可以反映神經元中NMDA受體的活化狀態(tài)。小鼠匹羅卡品模型的大腦皮質和海馬切片中觀察到了大量的pNMDARl陽性神經元。pNMDARl分布于細胞膜和細胞漿上。pNMDARl陽性神經元與D-serine陽性神經元在分布和數目的動態(tài)變化上顯示出了一定的相似性。
　　以上研究結果提示，癲癇發(fā)作后腦內D-serine的表達增多，D-serine的上調可能通過NMDA受體介導