伊馬替尼治療慢性粒細(xì)胞白血病的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、研究背景和目的：慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloidleLl kaemia，CML)是血液系統(tǒng)常見腫瘤增生性疾病之一，疾病侵犯血液系統(tǒng)中粒/巨噬系細(xì)胞，臨床表現(xiàn)為粒細(xì)胞顯著增多。流行病學(xué)資料顯示，CML中位發(fā)病年齡為45～55歲，其中一半的患者年齡超過60歲。 CML的分子遺傳學(xué)特征是費城染色體(Philadelphiachromosome，Ph)的出現(xiàn)。Ph染色體是由9q34上的Abelson小鼠白血病病毒癌基因

2、(Abelson murine leukaemia Viral oncogene，ABL)與22qll上的斷裂點聚集區(qū)(breakpoint cluster region，BCR)基因發(fā)生易位融合而成。該融合基因編碼的BCR-ABL融合蛋白具有異?；罨睦野彼峒っ富钚裕軌虺掷m(xù)磷酸化各種底物，促進細(xì)胞增生，抑制細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞之間連接，產(chǎn)生CML慢性期各種病理過程。繼發(fā)的其他基因異?？梢砸餋ML疾病由慢性期進展到加速期或急性期。

3、 目前，CML治療方法包括常規(guī)化學(xué)治療、干擾素a(Interferon-a，IFN-a)治療、異基因骨髓移植(allogenetic bone marrowtransplantation，allo-BMT)和造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stemcell transplantation，HSCT)等?；熾m然可以使大多數(shù)CML趨于穩(wěn)定，但是多年來CML中位數(shù)存活期并未明顯改善。異基因骨髓移植是有效根治CML的手段，但

4、是成功率與年齡有關(guān)，老年人身體基礎(chǔ)較差，成功率較低，因此對老年人患者并不適用。 甲磺酸伊馬替尼 (imatinib mesylate，簡稱伊馬替尼，STl571，格列衛(wèi) ，Gleevec /Glivec )是一種特異性ABL激酶抑制劑。它可以競爭性阻斷ABL激酶上三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點從而阻斷白血病的發(fā)病途徑，使CML的治療取得突破性進展。Ⅰ期至Ⅲ期國際臨床試驗已證實伊馬替尼可以使41％IFN-a治療無效的Ph陽性(Ph

5、+)慢性期CML患者和76％初治Ph+CML慢性期患者獲得完全遺傳學(xué)緩解，同時，對加速期和急性期患者也有很好療效。 但是，目前伊馬替尼治療CML仍存在兩大障礙。第一，伊馬替尼并不能逆轉(zhuǎn)致病基因BCR-ABL，即使患者達(dá)到完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解，體內(nèi)仍有殘留的白血病細(xì)胞，稱為微小殘留病(MRD)。近期研究認(rèn)為，這部分細(xì)胞多為處于靜止期的腫瘤干細(xì)胞，具有無限自我更新能力，對伊馬替尼不敏感，一定條件下可以重新進入細(xì)胞周期而造成患者復(fù)發(fā)。

6、第二，部分患者，尤其是加速期和急性期患者，最初對伊馬替尼反應(yīng)良好，但是隨著治療的進展會出現(xiàn)伊馬替尼耐藥，表現(xiàn)為患者復(fù)發(fā)或病程進展。 針對伊馬替尼治療中的兩大問題，本研究從分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)角度，研究伊馬替尼治療中腫瘤細(xì)胞殘余及耐藥發(fā)生的機制，建立臨床監(jiān)測MRD和預(yù)測伊馬替尼療效的方法，探討其臨床意義。 研究方法：應(yīng)用Taq man技術(shù)原理，建立實時定量RT-PCR方法，檢測CML患者骨髓和外周血BCR-ABL mR

7、NA轉(zhuǎn)錄水平。應(yīng)用該方法對17例伊馬替尼治療的Ph+慢性期CML患者，從治療開始，每3個月隨訪檢測骨髓和外周血BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平。中位隨訪時間30個月(9～33個月)，共檢測113對骨髓和外周血匹配樣本。結(jié)合患者臨床癥狀、外周血檢查、骨髓形態(tài)學(xué)檢查、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查評價伊馬替尼療效。建立實時定量RT-PCR檢測外周血凋亡相關(guān)基因B CL-2、BCL-X<,L>、BAX、BAD和BCL-Xs mRNA的表達(dá)水平。針對伊馬替尼治療過程中腫

8、瘤細(xì)胞殘留的問題，選取29例新診Ph+慢性期CML患者，給予伊馬替尼400mg/天治療，隨訪BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平至少l2個月。按照分子緩解標(biāo)準(zhǔn)，BCR—ABL轉(zhuǎn)錄水平較治療前下降至少3log(以10為底指數(shù)級)，將患者分為分子緩解組和分子未緩解組。比較患者治療前凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的差異，并建立logistic回歸模型，判斷患者治療前臨床和實驗室檢查指標(biāo)以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)與患者分子緩解與否的關(guān)系。針對伊馬替尼耐藥問題，通過半巢式

9、PCR擴增ABL激酶結(jié)構(gòu)域，并對該區(qū)域進行測序，尋找點突變；亞克隆患者BCR-ABL片斷，對單個克隆進行測序，以提高檢測點突變的敏感性，發(fā)現(xiàn)存在比例較少的點突變以及ABL激酶結(jié)構(gòu)域其他基因改變。應(yīng)用上述方法對4l例伊馬替尼治療的患者進行追蹤檢測，研究ABL激酶結(jié)構(gòu)域點突變發(fā)生幾率和發(fā)生時間，尋找ABL激酶結(jié)構(gòu)域其他基因改變。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和細(xì)胞遺傳學(xué)改變，探討ABL激酶結(jié)構(gòu)域分子遺傳學(xué)改變與臨床伊馬替尼耐藥的關(guān)系，探索伊馬替尼耐藥的可

10、能機制。 結(jié)果：實時定量RT-PCR檢測患者骨髓和外周血BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果有良好的相關(guān)性，同時，與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)檢查也有良好的相關(guān)性。伊馬替尼治療前，不同患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平相差較大，在1log即lO倍左右。獲得完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解的患者，BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平可以相差31og即l 000倍以上。伊馬替尼可以使幾乎所有患者外周血象和骨髓象恢復(fù)正常，70％患者達(dá)到完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解。伊馬替尼治療前6個月患者BCR-ABL

11、轉(zhuǎn)錄水平迅速下降，6～12個月BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平下降減緩。治療12～15個月之后，患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平進入平臺期，并可以長時間維持在該水平。 對CML患者檢測凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平顯示，CML患者BCL-2和BAD轉(zhuǎn)錄水平較正常人顯著降低，而分子緩解患者BAD轉(zhuǎn)錄水平顯著低于分子未緩解患者。Logistic回歸模型顯示BAD基因轉(zhuǎn)錄水平與CML患者經(jīng)伊馬替尼治療能否達(dá)到分子緩解顯著相關(guān)。通過對半巢式PCR擴增的

12、ABL激酶結(jié)構(gòu)域進行測序，共檢出8例患者存在該結(jié)構(gòu)域點突變。按照患者的病程區(qū)分，6.6％的早慢性期患者、43％晚慢性期患者和100％加速期患者被檢出點突變，晚慢性期和加速期患者突變檢出率顯著高于早慢性期患者。ABL結(jié)構(gòu)域點突變多于患者復(fù)發(fā)后被檢出，伊馬替尼治療前檢測不到點突變，患者復(fù)發(fā)前極少可以檢測到點突變。具有同樣點突變的患者，對伊馬替尼治療的反應(yīng)并不相同。部分患者即使復(fù)發(fā)后，點突變也不能被持續(xù)檢出。對部分患者BCR-ABL片斷亞克隆

13、進行測序分析，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)存在比例很少的點突變克隆，同時檢測出基因片斷的插入和缺失。 結(jié)論：利用實時定量RT-PCR檢測CML患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平，可以敏感、準(zhǔn)確的監(jiān)測MRD。伊馬替尼清除CML腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)雙相性，最初6個月清除速度快，BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平迅速降低，然后清除速度減緩，12～15個月BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平進入平臺期。伊馬替尼并不能清除所有腫瘤細(xì)胞，患者體內(nèi)有部分腫瘤干細(xì)胞殘留，成為CML復(fù)發(fā)根源；但伊馬替

14、尼可以有效的將這部分細(xì)胞長時間控制在靜止期。CML患者體內(nèi)細(xì)胞凋亡途徑失調(diào)，但是很難根據(jù)一、兩種基因的改變推測其對細(xì)胞凋亡最終結(jié)局的影響。凋亡相關(guān)基因的改變與CML患者伊馬替尼治療的分子反應(yīng)相關(guān)。CML患者ABL激酶結(jié)構(gòu)域點突變和伊馬替尼耐藥顯示出一定相關(guān)性。具有相同點突變的CML患者對伊馬替尼的反應(yīng)的不一致，以及部分患者具有點突變但未表現(xiàn)出臨床耐藥癥狀，表明ABL激酶結(jié)構(gòu)域點突變本身并不足以引起伊馬替尼耐藥。部分耐藥患者點突變不能被持

15、續(xù)檢出，即使復(fù)發(fā)后樣本也可以呈現(xiàn)野生型表現(xiàn)，表明突變克隆存在但不一定擴增。亞克隆測序結(jié)果顯示部分耐藥患者除了具有ABL激酶結(jié)構(gòu)域點突變外，還具有基因片斷的插入和缺失。這部分患者ABL激酶結(jié)構(gòu)域點突變的比例都比較小，因此，這些基因改變有可能是這部分患者發(fā)生伊馬替尼耐藥的原因。 意義：伊馬替尼的問世對CML的治療具有劃時代的意義，其療效卓越，在國際上成為治療CML的-線藥物。與其他化療藥物不同，伊馬替尼副反應(yīng)小，大多數(shù)患者均可耐受，

16、對不宜進行骨髓移植的老年患者提供了新的有效的治療。目前，如何解決伊馬替尼治療中的腫瘤細(xì)胞殘余和耐藥問題是世界性的課題。通過實時定量RT-PCR檢測患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平，可以有效的監(jiān)測MRD。該方法逐漸在臨床推廣應(yīng)用，對治療具有指導(dǎo)作用。應(yīng)用該方法所提出的“分子緩解”反映了患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殘余水平。實驗證實了CML患者凋亡途徑受到影響，因此篩選凋亡相關(guān)基因預(yù)測患者能否達(dá)到分子緩解具有可行性。對凋亡相關(guān)基因檢測的實驗結(jié)果經(jīng)進一步證實后

17、，可以作為預(yù)測患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殘余水平的分子標(biāo)志。ABL激酶結(jié)構(gòu)域點突變與伊馬替尼耐藥相關(guān)，尤其是加速期患者，點突變的檢出具有十分重要的臨床意義。對慢性期患者，伊馬替尼耐藥并不能被點突變所解釋，因此對檢測結(jié)果應(yīng)慎重考慮。隨著第二代酪氨酸激酶阻滯劑相繼出現(xiàn)，治療CML的選擇越來越多，如dasatinib已經(jīng)體內(nèi)外實驗和臨床實驗證實對伊馬替尼耐藥的患者有效。因此，應(yīng)用分子遺傳學(xué)手段及早對患者的療效做出準(zhǔn)確的判斷和預(yù)測，可以使患者從其他治療方