長春地辛群體藥代動力學：ABCB1遺傳多態(tài)性和表觀遺傳學差異的影響.pdf

1、長春地辛，是半合成的長春堿衍生物，廣泛應用于臨床惡性腫瘤包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。ABCB1是一種重要的藥物轉(zhuǎn)運蛋白，與許多惡性腫瘤的預后相關(guān)。體外研究已表明長春地辛是ABCB1的底物。ABCB1的基因多態(tài)性可以影響其表型，表遺傳因素也可能參與了ABCB1表達的調(diào)控。但是，目前沒有ABCB1基因多態(tài)性對長春地辛體內(nèi)藥代動力學影響的報道，也沒有表遺傳因素對任何藥物體內(nèi)藥代動力學影響的報道。同時，由于經(jīng)典的藥代動力學研究需要進行較密集的血

2、樣采集，很難在臨床上進行，特別對于許多血液病患者，反復多次采血的依從性很差。因此，進行了以下研究：(1)采用了群體藥代動力學的方法，通過有限的采血點建立長春地辛群體藥代動力學模型，估算群體參數(shù)值，再結(jié)合Bayesian反饋法，較準確地計算出個體參數(shù)。(2)比較3種ABCB1主要單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A、C1236T及由它們構(gòu)成的單倍體型在中國漢族健康人群和淋巴系統(tǒng)惡性疾病患者中的分布，觀察不同基因型之間啟動子區(qū)域甲基

3、化程度的差異。(3)研究C3435T、G2677T/A、C1236T單核苷酸多態(tài)性和單倍體型對長春地辛群體藥代動力學的影響。(4)初步探討ABCB1啟動子區(qū)域甲基化程度與長春地辛群體藥代動力學的影響。 為了完成本實驗，應用了以下研究方法： 1.建立長春地辛靜脈推注的群體藥代動力學模型 100名在中南大學湘雅醫(yī)院住院治療的中國漢族血液惡性腫瘤患者參加了本試驗。其中男性患者62名，女性患者38名?；颊呔鶈蝿┝拷o與長春

4、地辛3mg快速靜脈推注，推注結(jié)束后開始計時，依據(jù)計算機預先生成的采血時間表在0、5min，20min，1小時、3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時10個采血點中隨機采取2-3個時間點的靜脈血樣。HPLC-MS/MS法檢測血漿長春地辛濃度。使用非線性混合效應模型(NONMEM)進行計算，Bayesian回歸法推算個體藥代動力學參數(shù)。 2.ABCB1單核苷酸多態(tài)性基因型和單倍體型的測定 使用聚合酶鏈式反應-

5、限制性片斷長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)測定ABCB1的3個主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C1236T突變，應用PHASE2.0重構(gòu)單倍體型。 3.ABCB1啟動子區(qū)域甲基化分析 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(COBRA)進行啟動子區(qū)域甲基化分析。1-2μgDNA稀釋至50μl，變性后亞硫酸氫鈉硫化處理，使DNA中未甲基化的C轉(zhuǎn)化為T，PCR擴增，限制性內(nèi)切酶酶切后非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，EB

6、染色后進行灰度掃描。 4.統(tǒng)計方法 所有統(tǒng)計均使用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)的分析。不同基因型組間基因型分布頻率差異采用卡方檢驗。Hardy-Weinberg檢驗采用卡方檢驗。不同基因型之間的藥代動力學參數(shù)和啟動子區(qū)域甲基化程度差異使用Kruskal-Wallis檢驗和Mann-Whitney U檢驗。由于不能完全滿足雙正態(tài)分布，藥代動力學參數(shù)與啟動子區(qū)域甲基化程度的相關(guān)分析使用Speramen法。P<0.05被認為有

7、統(tǒng)計學意義。通過以上實驗，本課題的主要研究結(jié)果如下： 1.建立了長春地辛群體藥代動力學模型，表觀清除率(CL/F)、半衰期(T1/2)、表觀分布容積(V)和曲線下面積(AUC)等藥代動力學參數(shù)的均值分別為0.381±0.108L/h，22.8±10.4h，170.12±69.29L，149±67μg/L.h-1。除CL/F較報道稍高外，其余藥代動力學參數(shù)基本與I期臨床研究報道一致。 2.在中國漢族惡性淋巴系統(tǒng)腫瘤患者中，

8、ABCB1的C3435T單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子CC的頻率為34％，突變型純合子TT的頻率為22％，突變型雜合子CT的頻率為44％；ABCB1的C1236T單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子CC的頻率為10％，突變型純合子TT的頻率為48％，突變型雜合子CT的頻率為43％；ABCB1的G2677T/A單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子GG的頻率為18％，突變型純合子中TT的頻率為16％，TA的頻率為9％，AA的頻率為2％，突變型雜合子GT的頻率

9、為42％，GA的頻率為13％。在單倍體型分析中，12中可能的單倍體構(gòu)型組合中共有9種單倍體型被重構(gòu)，其中TTT、FGC、CGC和CAC占整個中國漢族人群的90％以上。與健康人比較，淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤患者的基因頻率和單倍體型頻率沒有顯著性差異。 3.健康志愿者和患者間甲基化程度存在顯著性差異。發(fā)現(xiàn)C3435T和G2677T/A不同基因型受試者中啟動子區(qū)域甲基化程度具有顯著性差異，C1236T不同基因型之間啟動子區(qū)域甲基化程度沒有顯著

10、性差異。 4.在ABCB1基因型對長春地辛群體藥代動力學的影響研究中，發(fā)現(xiàn)長春地辛藥代動力學參數(shù)CL/F個體間存在3.5倍的差異，但是ABCB1的3個主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C1236T各基因型和單倍體型之間的長春地辛藥代動力學參數(shù)均沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異。 5.在ABCB1啟動子區(qū)域甲基化程度對長春地辛群體藥代動力學的影響研究中，發(fā)現(xiàn)ABCB1啟動子區(qū)域甲基化程度與CL/F成正相關(guān)(rs=0.3

11、65)，與AUCrs=-0.366)、Vd(rs=-0.339)存在負相關(guān)。而與T1/2不存在相關(guān)性。 從本試驗中可以得出以下結(jié)論： 1.中國漢族血液惡性腫瘤患者中長春地辛的藥代動力學符合3室模型和一級動力學消除。本長春地辛群體藥代動力學模型可用于臨床藥代動力學研究和血藥濃度監(jiān)測，特別是當采樣受到限制，不能使用經(jīng)典的藥代動力學方法時。 2.ABCB1 3個主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C12

12、36T各基因型和單倍體型與淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病無關(guān)。中國漢族健康志愿者中ABCB1 3個主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A，C1236T各基因型和單倍體型頻率與淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤患者的基因頻率和單倍體型頻率相似。ABCB1基因啟動子區(qū)域甲基化程度與C3435T和G2677T/A基因型存在相關(guān)性，但是其機制和臨床意義還需要進一步探討。 3.ABCB1 3個主要的單核苷酸多態(tài)性C3435T、G2677T/A、C1236