hOCT1、ABCB1 mRNA水平及ABCB1基因多態(tài)性對伊馬替尼治療慢性粒細(xì)胞白血病療效的影響.pdf

1、背景與目的:
　　 慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelocytic leukemia，CML，慢粒）應(yīng)用分子靶向治療當(dāng)今已成為越來越重要的方法，伊馬替尼作為一個靶向啟動白血病的Bcr-Abl酪氨酸激酶的小分子抑制劑，已迅速成為慢性粒細(xì)胞白血病慢性期（chronic phase，CP-CML）患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療藥物。Interferon plus cytarabineand STI571(IRIS)的8年數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，無事

2、件生存率(event-free survival，EFS)高達(dá)81％，總生存率(overall survival，OS)達(dá)85％。在取得較好治療效果的同時，伊馬替尼的耐藥率近幾年越來越受到關(guān)注。根據(jù)IRIS研究中累積最佳血液學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)緩解率以及2009年European Leukemia Net(ELN)療效標(biāo)準(zhǔn)，有10％-25％的患者被認(rèn)為對伊馬替尼耐藥，即3個月未達(dá)到血液學(xué)緩解(completehematological res

3、ponse，CHR)或18個月未達(dá)到完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解(completecytogenetic response，CCR)。由于伊馬替尼必須與Bcr-Abl激酶相結(jié)合，影響細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的因素可能影響療效，目前比較明確的是伊馬替尼是P-糖蛋白（PgP）外排泵的作用底物，但多個研究結(jié)果對三磷酸腺苷結(jié)合盒蛋白B亞家族成員1（ABCB1）基因編碼蛋白PgP過表達(dá)是否影響伊馬替尼的耐藥性仍存在著爭議，蛋白表達(dá)水平與其功能也并非一定相關(guān)。有實驗近

4、期評估了多藥耐藥基因序列的多態(tài)性，并且發(fā)現(xiàn)了3種不同單核苷酸多態(tài)性會導(dǎo)致對伊馬替尼的不同MMR率，這說明不同的序列可能導(dǎo)致藥物外排泵的功效發(fā)生改變，進(jìn)而改變藥物的療效。近年，攝取轉(zhuǎn)運蛋白，特別是有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白1(hOCT1)被作為伊馬替尼耐藥的潛在根源進(jìn)行了研究，多個實驗結(jié)果表明，該基因的表達(dá)水平和功能均可影響伊馬替尼療效。臨床上患相同疾病的不同個體在使用同一種藥物治療時，效果有時會有較大差異，表現(xiàn)為耐藥或出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。其中遺傳

5、因素是導(dǎo)致藥物代謝反應(yīng)個體和人群差異的決定性因素。遺傳突變引起藥物代謝和反應(yīng)差異主要來自于編碼藥物代謝酶、受體和藥物轉(zhuǎn)運蛋白的基因的遺傳多態(tài)性。分析基因多態(tài)性的試驗方法主要有:聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(polymerase chain reaction-Restriction Fragment LengthPolymorphism，PCR-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation

6、polymorphism，SSCP)分析，序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction-sequence specific primer， PCR-SSP)、Southern印跡雜交方法、變性高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography and，DHPLC)以及變性梯度凝膠電泳分析(polymerase chain reaction denaturing

7、gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)等。本研究選取應(yīng)用伊馬替尼治療獲得不同療效CML患者，分析骨髓細(xì)胞hOCT1和ABCB1基因的mRNA表達(dá)水平對伊馬替尼療效的影響。對ABCB1高表達(dá)患者，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)及序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)技術(shù)，分析其C1236T、C3435T、G2677T三個位點單核苷酸多態(tài)性對伊馬替尼治療CML療

8、效的影響。
　　 方法:
　　 1.hOCT1、ABCB1基因mRNA表達(dá)水平對IM治療CML療效的影響
　　 1.1.研究對象:2008年1月至2011年6月在我院診斷并服用IM治療的CML患者90例，中位年齡40(11-77)歲，男性61例，女性29例。其中慢性期(CP)88例，加速期(AP)2例。診斷后至應(yīng)用IM治療前的中位病程2月（7天-5年），應(yīng)用IM中位劑量400(300-800) mg/日，中位療程

9、30(1-117)月。按臨床療效標(biāo)準(zhǔn)[9]評估療效，并依據(jù)結(jié)果進(jìn)一步分析耐藥組17例（18.9％，其中原發(fā)耐藥12例繼發(fā)耐藥5例）、部分細(xì)胞遺傳學(xué)緩解(PCyR)組11例(12.2％)、CCR組62例(68.9％)分別與hOCT1和ABCB1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系。
　　 1.2.引物設(shè)計與合成:根據(jù)GeneBank的序列設(shè)計hOCT1、ABCB1基因及內(nèi)參基因GAPDH引物及探針。
　　 1.3.提取白血病患者骨髓單

10、個核細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR。通過熔解曲線確定PCR產(chǎn)物的特異性。取兩管平均Ct值計算2-ΔCT值，作為各標(biāo)本mRNA的相對表達(dá)量，ΔCT=（目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值）。比較CML患者耐藥組、PCyR組和CCR組間hOCT1和ABCB1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系，兩基因表達(dá)水平與IM療程的關(guān)系。以本實驗檢測表達(dá)水平中位數(shù)為界，將研究對象分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，比較兩組間獲CCR時間及比例的差異。<

11、br>　　 1.4.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)描述;兩組計量資料間分布比較用Kruskal-Wallis H法檢驗;兩變量間相關(guān)分析采用Spearman rank correlation analysis;生存分析用Kaplan-Meier曲線;檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。
　　 2.ABCB1基因多態(tài)性與IM治療CML療效的關(guān)系
　　 2.1.研究對象:2008年1月至2

12、011年6月在我院診斷并服用IM治療的CML患者中經(jīng)PCR檢測ABCB1 mRNA水平高表達(dá)者48例，中位年齡38(11-68)歲，男性32例，女性16例。其中慢性期(CP)46例，加速期(AP)2例。應(yīng)用IM中位劑量400(300-800) mg/日，中位療程27(1-105)月。按臨床療效分為未達(dá)CCR組18例(37.5％，其中原發(fā)耐藥11例、繼發(fā)耐藥5例、部分細(xì)胞遺傳學(xué)緩解(MCyR)2例）、完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解(CCR)組19例(

13、39.6％)、MMR組11例(22.9％)。
　　 2.2.對ABCB1高表達(dá)患者進(jìn)行基因多態(tài)性分析:采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶法(PCR-RFLP)分析ABCB1 C1236T、C3435T多態(tài)性;因ABCB1 G2677T位點無特異性限制性內(nèi)切酶，采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)分析其多態(tài)性。對表現(xiàn)型反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化測序，結(jié)合瓊脂糖電泳結(jié)果確定所擴增片斷為所需目的基因片斷。
　　 2.3.用專門

14、軟件(HWE)對檢測人群基因型頻率進(jìn)行Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗。統(tǒng)計學(xué)處理:采用Pearson x2檢驗比較各基因型、等位基因頻率在伊馬替尼治療不同療效組間差異，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.RNA、cDNA純度和質(zhì)量分析:所提取總RNA、cDNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，比值在1.8～2.0之間。
　　 2.任選一cDNA以10倍倍比稀釋，目的基因和內(nèi)參基因的CT值

15、差(ΔCT)幾乎不隨模板濃度變化而變化，目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率基本一致。擴增后進(jìn)入熔解程序生成熔解曲線，熔解曲線顯示銳利的單一峰，無其它特異峰，說明擴增產(chǎn)物均一，無非特異擴增及引物二聚體。瓊脂糖凝膠電泳顯示兩基因所擴增片段條帶單一，無引物二聚體和非特異性擴增。同樣的原理擴增ABCB1基因。
　　 3 hOCT1、ABCB1mRNA表達(dá)水平與疾病狀態(tài):耐藥組、PCyR組和CCR組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為x2=9.761，

16、P=0.008;x2=8.511，P=0.014。采用多重比較分析，CCR組hOCT1 mRNA表達(dá)水平高于耐藥組和PCyR組(P=0.047、0.019)，耐藥組ABCB1 mRNA表達(dá)水平高于CCR和PCyR組(P=0.045、0.021)。
　　 4.療程與hOCT1、ABCB1 mRNA表達(dá)的關(guān)系:比較服用IM時間3～6、～12、～24、～48、＞48月患者的hOCT1、ABCB1 mRNA水平。不同療程組間hOCT1、

17、ABCB1 mRNA均無統(tǒng)計學(xué)差異，x2=5.178，P=0.270，x2=4.298，P=0.367。
　　 5.hOCT1、ABCB1 mRMA水平與獲CCR時間及其相互關(guān)系:hOCT1高表達(dá)組CCR時間明顯提前于低表達(dá)組間，x2=7.506，P=0.006;ABCB1低表達(dá)組達(dá)CCR時間明顯提前于高表達(dá)組，x2=3.870，P=0.049，18月內(nèi)達(dá)CCR患者比例hOCT1高表達(dá)組、ABCB1低表達(dá)組均明顯增高(97％ V

18、s89％，97％ Vs88％)，且在治療6個月時最為顯著(76％ Vs53％，74％ Vs53％)。應(yīng)用Spearman相關(guān)系數(shù)法比較分析，兩基因mRNA水平呈負(fù)相關(guān)性，r=-0.655，P＜0.001。
　　 6、人群基因型頻率Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗，實際數(shù)與理論數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均大于0.5）人群均符合Hardy-weinberg遺傳平衡，適合進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。
　　 7、ABCB1 C12

19、36T、C3435T、G2677T基因型分布在ABCB1高表達(dá)患者未達(dá)CCR組、CCR和MMR組間均不存在統(tǒng)計學(xué)差異。但在未達(dá)CCR患者C1236T位點T等位基因頻率高于C（x2=4.00，P=0.046），C3435T、G2677T中C和G等位基因頻率均分別明顯高于T(x2=7.111，5.444，;P=0.008、0.02)。
　　 結(jié)論:
　　 1.所提取RNA的cDNA純度高、質(zhì)量好，可用于后續(xù)實驗。
　　

20、 2.所設(shè)計的各基因引物特異性好、與管家基因擴增效率一致。
　　 3.CCR組hOCT1 mRNA的表達(dá)水平高于耐藥組和PCyR組;耐藥組ABCB1 mRNA的表達(dá)水平高于CCR和PCyR組。耐藥組伴有hOCT1低表達(dá)和（或）ABCB1高表達(dá)，說明藥物轉(zhuǎn)運蛋白是IM治療成功的重要因素之一。
　　 4.IM治療療程不影響兩基因的表達(dá)水平，提示hOCT1和ABCB1 mRNA水平在IM治療期間的穩(wěn)定性可靠，不受用藥時間的影