高表達重組TCS對人宮頸癌Caski細胞p73基因甲基化影響的機制研究.pdf

1、目的:觀察高表達 rTCS對宮頸癌 Caski細胞增殖和細胞周期,及甲基化轉(zhuǎn)移酶I(DNA methyltransferase,DNMT1)的表達和抑癌基因 p73啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響。探索高表達 rTCS是否能抑制Caski細胞生長,是否具有去甲基化作用,能否誘導(dǎo) p73基因重新表達,從而為 rTCS抗宮頸癌藥效及機制研究提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)限制性內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳切膠回收、T4連接酶連接等方法構(gòu)建真核表

2、達質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/6xHis-TCS。(2)反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)、實時定量PCR(FQ-PCR)、蛋白免疫印記(Western-blot)篩選高表達 rTCS的Caski細胞株,及檢測 DNMT1和p73的表達情況。(3)MTT還原測定法比較分析細胞生長情況。(4) FCM用于分析細胞周期變化。(5)甲基化特異性 PCR(methylation-specific PCR, MSP)法檢測 p73基因5ˊ端啟動子區(qū)

3、 CpG島甲基化狀態(tài)的改變。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建 rTCS真核表達質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/6xHis-TCS,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Caski細胞株,經(jīng) G418篩選,RT-PCR和Western-blot鑒定,獲得高表達 rTCS的Caski細胞株。(2)高表達 rTCS的Caski細胞(實驗組)增殖速度明顯低于對照組,二者在24h、48h、72h均具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01);FCM結(jié)果顯示:實驗組細胞 G1期和G

4、2期細胞數(shù)比例高于對照組(p<0.5),而S期較對照組低(p<0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(3)實驗組細胞 DNMT1在 mRNA及蛋白水平的表達均低于對照組,其中mRNA水平降低0.56倍(p<0.01)。(4)實驗組細胞 p73基因啟動子甲基化程度比對照組細胞有所降低,而p73mRNA表達水平高于對照細胞。
　　結(jié)論:(1)rTCS高表達能夠顯著抑制Caski細胞增殖并能將細胞抑制在 G1和G2期,且隨時間延長,抑制程度增