反義肽核酸封閉線粒體DNA轉(zhuǎn)錄啟動子對肺癌細胞-肺癌干細胞生物學特性影響的初步研究.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。由于不良生活習慣和環(huán)境污染等因素,其發(fā)病率不斷上升(近30年來我國肺癌發(fā)病率上升了465％),已成為我國發(fā)病率、死亡率第一的惡性腫瘤[1]。然而,目前臨床肺癌綜合治療措施的效果尚不理想,患者5年生存率＜15％[2]。因此,尋找新的治療靶點和新的治療方法,顯得尤為迫切。
　　線粒體是真核細胞最重要的供能細胞器,參與能量代謝、保持離子穩(wěn)態(tài)、細胞增殖和凋亡等眾多生理/病理過程。線粒體DNA(Mitocho

2、ndrial DNA,mtDNA)作為真核細胞唯一的核外遺傳物質(zhì),編碼13個與能量代謝相關(guān)的多肽,其損傷和轉(zhuǎn)錄障礙將導致所編碼的多肽表達減少,電子傳遞鏈效率下降,滲透性轉(zhuǎn)換孔開放,細胞凋亡[3];越來越多的證據(jù)表明,線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變,不僅會干擾腫瘤細胞的生長、能量代謝和增殖等過程,最終還會觸發(fā)腫瘤細胞凋亡及壞死[4]。因此,以肺癌細胞線粒體作為治療靶點是一個值得探索的方向。如果能應用反義技術(shù)和反義物質(zhì),特異性地封閉肺癌細胞mtDN

3、A的轉(zhuǎn)錄啟動子,則可能導致線粒體蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)障礙,從而引起線粒體電子傳遞鏈障礙,繼而影響肺癌細胞的生存和正常功能的維持。
　　本研究1.觀察比較了多種肺癌細胞和正常人支氣管上皮細胞線粒體膜電位,證實了肺癌細胞的線粒體膜電位是高于正常人支氣管上皮細胞的線粒體膜電位。2.構(gòu)建了反義肽核酸(Anti-sense peptide nucleic acid,asPNA)-三苯磷復合物,利用電子移位親脂性陽離子類物質(zhì)(delocaliz

4、ed lipophilic cations,DLCs)-三苯磷,能夠在高線粒體膜電位的推動下,選擇性地積聚于肺癌細胞線粒體內(nèi)的特性[5],運載針對mtDNA重鏈轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域的asPNA,阻抑肺癌mtDNA編碼基因的轉(zhuǎn)錄,觀察其對肺癌細胞能量產(chǎn)生、凋亡/壞死等生物學特性的影響。
　　研究過程中,我們發(fā)現(xiàn)肺癌細胞群體內(nèi)部,線粒體膜電位也存在明顯的異質(zhì)性,而這種異質(zhì)性同肺癌細胞分化程度之間存在聯(lián)系,即肺癌干細胞亞群的線粒體膜電位高于

5、分化的肺癌細胞。3.我們在分離鑒定肺癌干細胞的基礎上,還進一步觀察了asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染后,對肺癌干細胞亞群生物學性質(zhì)的影響。
　　方法:
　　1.分別采用流式細胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測比較不同肺癌細胞系(SPC-A1、H446)與正常人支氣管上皮細胞(Human Bronchus Epithelium,HBE)的線粒體膜電位。
　　2.設計并用固相合成法合成asPNA-三苯磷復合物;用高壓液相色譜法

6、和質(zhì)譜法進行鑒定;激光共聚焦顯微鏡觀察復合物轉(zhuǎn)染肺癌SPC-A1細胞;RT-PCR法檢測asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細胞mtDNA重鏈編碼基因ATP合酶8(ATPase8)表達情況;自發(fā)光熒光儀檢測asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細胞的ATP合成的變化;用PI標記流式細胞術(shù)觀察asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細胞后的細胞周期;Annexin-v-PI雙染流式細胞術(shù)檢測asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染后SPC

7、-A1細胞凋亡/壞死。
　　3.觀察不同腫瘤細胞系(A549、SPC-A1、H446、SGC、Hela)的克隆異質(zhì)性;并用激光共聚焦顯微鏡檢測不同克隆中細胞的線粒體膜電位;了解腫瘤細胞線粒體膜電位的異質(zhì)性;免疫熒光法檢測SPC-A1細胞不同克隆中干細胞標志物的表達情況;激光共聚焦顯微鏡觀察不同克隆中SP細胞的分布情況及不同克隆中細胞線粒體的分布情況。
　　4.根據(jù)肺癌細胞緊密型克隆具有干細胞特性,采用改進的無血清干細

8、胞培養(yǎng)法,于SPC-A1中培養(yǎng)肺癌干細胞球;獲取肺癌干細胞球后,免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測其CD133表達;利用裸鼠成瘤實驗檢測肺癌干細胞的致瘤能力;流式細胞儀檢測比較肺癌干細胞球和分化肺癌SPC-A1細胞的線粒體膜電位。
　　5.激光共聚焦顯微鏡觀察asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染肺癌干細胞的效果,利用裸鼠成瘤實驗檢測轉(zhuǎn)染asPNA-三苯磷復合物肺癌干細胞的成瘤能力。
　　6.統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差表示,組間比較

9、采用t檢驗,以SPSS12.0軟件進行分析。P＜0.05為差異顯著。
　　結(jié)果:
　　1.肺癌細胞的線粒體膜電位要高于正常人支氣管上皮細胞。
　　流式細胞術(shù)檢測結(jié)果:熒光強度代表線粒體膜電位,SPC-A1(266.924.4,P＜0.01)和H446細胞(194.4±17.0,P＜0.01)高于HBE(138.1±19.7)。
　　激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果:熒光強度代表線粒體膜電位,SPC-A1(1.90

10、±0.06,P＜0.01)和H446細胞(1.91+0.03,P＜0.01)高于HBE(1.72±0.02)。
　　2.asPNA-三苯磷復合物符合要求。
　　asPNA-三苯磷復合物高壓液相色譜鑒定結(jié)果顯示,在22.1min處可見一單峰,未見明顯的雜質(zhì)峰,與標準品一致;添加電荷后,質(zhì)譜分析:復合物分子量為3982.2,而設計asPNA-三苯磷復合物,其分子量為3979.9,表明:asPNA-三苯磷復合物符合設計要求。

11、
　　3.asPNA-三苯磷復合物進入SPC-A1細胞線粒體并產(chǎn)生預期生物學效應。
　　激光共聚焦顯微鏡觀察顯示asPNA-三苯磷分布于細胞質(zhì)中,形態(tài)和空間分布同線粒體基本一致,表明asPNA-三苯磷復合物能夠進入肺癌SPC-A1細胞線粒體內(nèi)。
　　RT-PCR結(jié)果顯示asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染后SPC-A1細胞mtDNA重鏈編碼基因ATPase8轉(zhuǎn)錄水平下降;流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染組可

12、見明顯的亞二倍體峰,凋亡檢測顯示轉(zhuǎn)染后SPC-A1細胞的凋亡率也增加(轉(zhuǎn)染:11.83％±0.66％,未轉(zhuǎn)染:2.56％±0.71％),提示,部分細胞發(fā)生了凋亡/壞死;對轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組ATP的檢測發(fā)現(xiàn)asPNA-三苯磷復合物轉(zhuǎn)染肺癌SPC-A1細胞能夠減低ATP的合成(轉(zhuǎn)染:1.2049±0.1122 nmol/mg蛋白,未轉(zhuǎn)染:2.1983±0.1570 nmol/mg蛋白,P＜0.01)。
　　4.腫瘤細胞線粒體膜電位存在

13、異質(zhì)性,且與細胞分化狀態(tài)相關(guān)。
　　激光共聚焦顯微鏡對腫瘤細胞系不同克隆細胞線粒體膜電位檢測結(jié)果:緊密克隆中細胞線粒體膜電位要高于松散型克隆(A549緊密型:854.5±71.96,松散型:618.9±62.2,P＜0.01;SPC-A1緊密型:2029.8±45.9,松散型:1016.6±104.5,P＜0.01:H446緊密型:1175.6±115.3,松散型:848.2±93.8,P＜0.01;SGC緊密型:1498.

14、9±169.2,松散型:912.3±67.1,P＜0.01;Hela緊密型:835.9±98.6,松散型:531.2±44.8,P＜0.01)。
　　肺癌緊密型克隆的細胞具有能夠表達干細胞標志物、細胞的線粒體分布更靠近細胞核等干細胞特性。
　　5.獲得肺癌干細胞球,并初步鑒定。
　　利用改進的無血清培養(yǎng)法,成功獲得呈球狀生長的肺癌干細胞球,所培養(yǎng)的肺癌干細胞球表達干細胞標志物CD133,具有較強的成瘤能力。

15、r>　　6.肺癌干細胞球線粒體膜電位高于分化的肺癌SPC-A1細胞。
　　流式細胞術(shù)檢測結(jié)果:熒光強度代表線粒體膜電位,肺癌干細胞(84.45±12.54)高于SPC.A1(53.53±3.35,P＜0.01)。
　　7.asPNA-三苯磷能夠順利進入肺癌干細胞內(nèi),并影響其成瘤能力。
　　激光共聚焦觀察顯示asPNA-三苯磷分布于細胞質(zhì)中,形態(tài)和空間分布同線粒體基本一致,熒光物質(zhì)靠近細胞核周分布相對較密集,符合干

16、細胞線粒體分布規(guī)律,提示asPNA-三苯磷復合物能夠順利的轉(zhuǎn)染肺癌干細胞線粒體內(nèi)。
　　結(jié)論:
　　1.肺癌細胞的線粒體膜電位高于正常人支氣管上皮細胞。
　　2.asPNA-三苯磷復合物能夠在高線粒體膜電位的推動下,積聚于肺癌細胞內(nèi),并阻抑其線粒體DNA編碼基因的表達,干擾能量代謝,導致細胞凋亡。
　　3.肺癌細胞群體內(nèi),線粒體膜電位存在異質(zhì)性,并同細胞分化程度呈負相關(guān)。
　　4.asPNA-三苯