mir-503靶基因PRKACA的鑒定及其在食管鱗癌細胞中的生物學功能.pdf

1、目的:檢測應激條件下miR-503的表達;鑒定miR-503的靶基因PRKACA;研究PRKACA基因編碼的蛋白對食管鱗癌細胞Eca9706和Eca109功能的影響及其生物學機制。
　　方法:1、分別在缺糖、缺氧及饑餓條件下培養(yǎng)Eca109和Eca9706細胞，采用Taqman探針法檢測miR-503的表達情況。
　　2、體外設計并合成3組干擾PRKACA mRNA表達的siRNA,采用脂質體法轉染食管鱗癌細胞株Eca109

2、和Eca9706。
　　3、 Western Blot方法檢測轉染PRKACA-siRNA后Eca109的PRKACA蛋白的表達水平，評估干擾效果。
　　4、通過CCK-8試劑盒檢測干擾PRKACA基因表達后Eca109和Eca9706細胞增殖能力的改變。
　　5、Transwell侵襲實驗法檢測PRKACA對Eca109和Eca9706細胞的侵襲轉移能力的影響。
　　6、利用流式細胞術分析PRKACA基因對Ec

3、a109和Eca9706細胞周期的影響。
　　7、將miR-503mimics及miR-503 negative control分別轉染Eca109，之后采用偶聯AGO2抗體的beads來免疫沉淀miRNA-mRNA-AGO2蛋白復合體，而在另一組實驗中采用IgG替換AGO2抗體，然后都用TRizol法來抽提沉淀的總RNA，最后實時定量PCR法檢測PRKACA mRNA的表達。
　　8、擴增PRKACA3'-UTR的種子區(qū)及

4、突變種子區(qū)，且在兩端加上SpeⅠ和HindⅢ酶切位點后構建至雙熒光素酶報告質粒pMIR-PRKACA和pMIR-PRKACA-mutant;將miR-503 mimics、miR-503 negative control、pMIR-PRKACA和pMIR-PRKACA-mutant，分別共轉染HEK293細胞;裂解細胞后加入底物，檢測熒光素酶活性。
　　9、通過生物信息學方法即GO基因分類法、KEGG Pathways法預測miR

5、-503在食管鱗癌中靶基因。
　　10、統(tǒng)計學分析:所有實驗數據均使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包，兩指標間的比較采用LSD-t檢驗，兩項以上的采用單因素方差分析;計量資料采用t檢驗;差異性分析用配對x2檢驗;相關性檢驗用Spearman相關分析，以α=0.05為標準。
　　結果:1、Taqman探針法結果表明，在缺糖、缺氧及饑餓條件下，Eca109和Eca9706中的miR-503的表達水平顯著升高;
　　2、siRN

6、A轉染Eca109細胞，分別命名為PRKACA-siRNA-Eca109-1、PRKACA-siRNA-Eca109-2、PRKACA-siRNA-Eca109-3和siRNA-NC組，經過48h的培養(yǎng)，使用Western Blot篩選對PRKACA基因表達干擾效果最好的siRNA。
　　3、轉染siRNA-PRKACA后48h，與對照組比較的結果顯示，PRKACA-siRNA-Eca109-3組的PRKACA蛋白的表達水平明顯降

7、低(P＜0.05)，顯示干擾siRNA序列能夠顯著下調PRKACA的表達，同時Vimentin表達相對下調，E-cadherin表達升高，CyclinD1和CyclinE1蛋白的表達水平降低。
　　4、CCK-8實驗結果顯示，PRKACA基因抑制組食管鱗癌細胞增殖速度減慢(P＜0.05)，對照組細胞的增殖速度加快(P＜0.05)。表明PRKACA能夠促進食管鱗癌細胞的增殖;
　　5、Transwell實驗檢測干擾組食管鱗癌細

8、胞。遷移實驗，Eca109的mimics組鏡下細胞數是55個，Eca9706(x100)的mimics組為82個;侵襲實驗，Eca109及Eca9706的mimics組分別為47、51個;兩個細胞株的兩組實驗相較對照組都有顯著性差異(P＜0.05)。說明PRKACA基因的表達能夠促進Eca109及Eca9706細胞的侵襲轉移。
　　6、流式細胞檢測siRNA-PRKACA陽性的Eca細胞。Eca109組G0/G1細胞比例61.47

9、％，S期比例20.95％，G2/M期17.58％;Eca9706組G0/G1細胞比例68.18％，S期比例17.61％，G2/M期14.21％;兩組細胞與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。表明PRKACA基因的抑制可以導致食管鱗癌細胞G1期的阻滯。
　　7、通過GO基因分類法、KEGG Pathways法發(fā)現與miR-503緊密相關的PRKCG、PRKACA、RICTOR、SMAD7、WNT4及WNT3A，都可能是miR-

10、503的靶基因。
　　8、RIP實驗顯示，miR-503 mimics組PRKACA mRNA的表達水平顯著高于miR-503 negative control組(P＜0.05)，推測PRKACA是miR-503的靶基因。
　　9、實驗組中熒光素酶活性相比對照組顯著降低(P＜0.05)，顯示miR-503 mimics對pMIR-PRKACA的熒光素酶表達有抑制作用，提示PRKACA是miR-503的靶基因;miR-503

11、mimics和pMIR-PRKACA-mutant共轉染組熒光強度顯著降低，而對照組無顯著改變，說明miR-503 mimics對pMIR-PRKACA-mutant表達有抑制作用，表明PRKACA是miR-503的靶基因。
　　結論:1.說明缺氧、缺糖及饑餓是誘發(fā)食管鱗癌細胞miR-503表達升高的重要因素。
　　2.SiRNA干擾PRKACA蛋白，提示PRKACA具有促進食管鱗癌細胞的增殖、侵襲及遷移的作用。