重組黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶在甲醇酵母中表達的改善和基于此的新型農(nóng)藥殘留快速檢測傳感器的改進.pdf

1、基于酶抑制法原理的農(nóng)藥殘留快速檢測方法在我國應用最為廣泛,但有兩點缺陷嚴重限制了其發(fā)展和進一步應用:首先,關(guān)鍵酶乙酰膽堿酯酶的靈敏度不能滿足越來越嚴格的檢測要求;其次,采用的光學分析手段易受色素等物質(zhì)干擾,測試范圍小。本文在已有基礎上,通過酵母密碼子優(yōu)化等,利用重疊PCR方法改造了黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶DmAChE cDNA序列,在此基礎上構(gòu)建了以AOX啟動子的酵母表達載體pPIC9K/DmAChE,在通過電擊轉(zhuǎn)化和MM平板快速篩選,進而

2、獲得了一株高表達R-DmAChE菌株,其搖瓶培養(yǎng)條件下該重組酶可被分泌到培養(yǎng)基中,性達718 U/mL,相比我們已經(jīng)報道的未優(yōu)化密碼子時獲得轉(zhuǎn)化菌株的表達水平提高了3.4倍。在此基礎上,我們將獲得的高靈敏度重組乙酰膽堿酯酶用于電化學生物傳感器的研制,并在其中利用碳納米管來提高傳感器的性能。采用通過碳納米管介導電聚合普魯士藍作為電子傳遞媒介,可降低產(chǎn)生信號所需的氧化電壓至200 mV;酶的固定采用傳統(tǒng)可靠的戊二醛共價偶聯(lián)法。碳納米管憑借其

3、巨大的比表面積不僅增加了普魯士藍的聚合量,還將信號電流值提高了40％,并將信號平衡時間縮短了300%;此外,憑借碳管創(chuàng)造的特殊微環(huán)境,酶傳感器的熱穩(wěn)定性得到了提高,對一些農(nóng)藥檢測靈敏度也顯著提高,如對克百威的檢測靈敏度提高了至少10倍。在4種加標飲料種探測出0.5μg/L敵敵畏和5μg/L克百威,說明該傳感器能夠抵抗糖、咖啡因、酒精、維生素和蛋白質(zhì)的干擾。因此,本文中獲得高表達量、高靈敏度的重組果蠅乙酰膽堿酯酶可為我國農(nóng)藥殘留檢測提供優(yōu)