FPV復(fù)制非必需位點(diǎn)的篩選及重組病毒生物學(xué)特性比較.pdf

1、雞痘病毒(Fowlpox Virus，F(xiàn)PV)基因組龐大，其基因組由260～309 kb雙鏈DNA組成，含有大量的復(fù)制非必需區(qū)可以作為外源基因的插入位點(diǎn)，可以容納25～30 kb的外源基因。而且，F(xiàn)PV只對禽類有感染性，病毒不能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)增殖，使得FPV作為載體有很好的生物安全性。FPV作為動(dòng)物病毒的表達(dá)載體表現(xiàn)出了其獨(dú)特的優(yōu)越性。
　　以FPV為載體的重組病毒活載體疫苗在近二十多年來取得了很大的進(jìn)展，特別是一些如禽流感、新城

2、疫、傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病及馬立克氏病等引起禽類疾病的病毒的保護(hù)性抗原基因已經(jīng)在FPV上成功表達(dá)。構(gòu)建以FPV為載體的重組病毒的過程中，首先要做的就是對病毒復(fù)制非必需區(qū)的選擇。但是，現(xiàn)在國內(nèi)在FPV重組位點(diǎn)的選擇上研究還比較少，而且重組位點(diǎn)的選擇會(huì)影響到重組病毒的復(fù)制能力及外源基因的表達(dá)水平。因此，篩選并優(yōu)化以我國的FPV疫苗株為基礎(chǔ)的復(fù)制非必需區(qū)是至關(guān)重要的，這也對以后構(gòu)建高效安全的重組FPV載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

3、
　　本研究采用定向克隆的方法篩選FPV的復(fù)制非必需區(qū)。在復(fù)制非必需區(qū)的選擇上，盡量以不影響FPV的復(fù)制、毒力及生物學(xué)特性為基礎(chǔ)。為篩選高效的FPV基因組外源基因的插入位點(diǎn)，本研究選擇FPV的FPV054基因內(nèi)部及FPV161與FPV162之間的基因間隔區(qū)作為重組位點(diǎn)，構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的轉(zhuǎn)移載體，以表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組FPV（rFPV-gB）為親本病毒，通過在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中同

4、源重組，制各表達(dá)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的重組雞痘病毒，經(jīng)過3輪蝕斑純化篩選獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組病毒，分別命名為rFPV054-EGFP和rFPV161-EGFP。將重組病毒與親本病毒連續(xù)傳代20代，通過對每5代病毒的PCR鑒定，檢測到外源基因在病毒的傳代過程中始終存在，且沒有發(fā)生改變;同時(shí)，對外源基因表達(dá)的免疫印記檢測也進(jìn)一步證明了所表達(dá)的蛋白的抗原性;通過對每代病毒所感染的細(xì)胞的熒光觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白基因能穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。復(fù)