藍白斑篩選技術的改進及其生物醫(yī)學應用.pdf

1、目的:探討藍白斑篩選技術在生物醫(yī)學方面的新應用:(1) TALENs(transcription activator-like effector nucleases)活性檢測和脫靶效應評估;(2)檢測EGFR基因外顯子19堿基缺失突變新方法。
　　方法:設計合成一系列片段長度小于150bp的插入片段,將插入片段與兩種T/A克隆載體(pGEM-T Easy vector和 pTrueBlue vector,具有不同的插入位點,分別位

2、于密碼子7和另一個是密碼子11和36之間)連接,進行分子克隆,進一步觀察菌落顏色并通過測序驗證;人工構建基于藍白斑篩選的含有TALENs靶序列的報告質粒,進一步提出一種原核水平檢測TALENs有效性方法的可能性;設計一組特異性PCR引物,以樣本DNA(如人工構建的EGFR野生型、突變型質粒、腫瘤組織DNA、血中游離DNA等)為模板進行PCR,進一步進行分子克隆。結合藍白斑篩選,人為改變閱讀框架,致使野生型閱讀框架中含有終止密碼子TAA,

3、缺失突變型因丟失一段核酸片段而不含有終止密碼子TAA,從而通過觀察菌落的顏色來確定樣品有無EGFR基因外顯子19的堿基缺失突變。
　　結論:基于兩種不同插入位點的TA克隆載體(pGEM-T Easy vector和pTrueBlue vector),若插入片段若是3的整數(shù)倍則菌落呈藍色;若是3的非整數(shù)倍則菌落呈白色。因此,理論上插入或缺失突變若導致LacZ閱讀框移碼則呈現(xiàn)菌落藍色變?yōu)榘咨默F(xiàn)象。成功構建2種含有TALENs靶序列的

4、報告質粒,2種質粒的LacZ閱讀框分別為移碼與非移碼,對應菌落顏色為白色、藍色;在此基礎上提出一種檢測TALENs有效性的方法,即當TALENs特異性剪切藍白斑篩選載體上的靶序列時,導致多肽閱讀框的非移碼與移碼變換,從而共轉化后菌落顏色改變。該體系還可廣泛應用于鋅指蛋白核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs),CRISPR-cas系統(tǒng)(CRISPR–Cas systems)有效性檢測。分別以人工構建的EGFR野生型