納米傳感與傳輸技術(shù)研究及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、生物納米技術(shù)是一門前沿的新興交叉學(xué)科，它的發(fā)展為生物醫(yī)學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的研究與發(fā)展提供了新的思路和手段。但是，許多工作都還處于初步發(fā)展階段，遠未達到廣泛實際應(yīng)用的水平，因此納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用還需要進一步的開發(fā)與發(fā)展。近年來，本研究小組在結(jié)合納米技術(shù)、分析技術(shù)、生物技術(shù)以及材料制備技術(shù)的基礎(chǔ)上，開展了以核殼生物納米顆粒為核心的系統(tǒng)研究工作。本論文在相關(guān)工作的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入開展納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，著重圍繞基于納米顆粒

2、的納米傳感器件與基因傳輸器件開展工作，取得了以下幾個方面的成果： 1.首次利用反相微乳液技術(shù)發(fā)展了一種同時包埋pH敏感染料(FITC)和參比染料(RuBPY)的硅殼熒光納米顆粒，構(gòu)建了一種適合細胞內(nèi)pH測量的比例型納米pH傳感器。該傳感器大小在42nm左右，大小均勻，水溶液中分散性好，抗光漂白能力強，響應(yīng)重現(xiàn)性好，線性范圍為pH4-7，檢測靈敏度為0.05pH。利用它尺寸小的優(yōu)勢，納米pH傳感器通過細胞的胞吞作用可以無損傷地進入

3、細胞，實現(xiàn)細胞內(nèi)pH的高靈敏、準(zhǔn)確、實時、原位、非侵入式的無創(chuàng)快速監(jiān)測，而且比例型納米pH傳感器可以改善染料濃度、細胞數(shù)量及環(huán)境變化等因素的影響，實現(xiàn)細胞內(nèi)pH的定量化研究。細胞內(nèi)的應(yīng)用表明，本文制備的納米pH傳感器可以實時測定藥物刺激細胞后胞內(nèi)pH的動態(tài)變化，并且發(fā)現(xiàn)了地塞米松誘導(dǎo)HeLa細胞的凋亡首先經(jīng)歷了一個細胞內(nèi)酸化過程，為揭示細胞凋亡機制提供了一種新的研究手段，也為抗癌策略——誘導(dǎo)癌細胞酸化的用藥提供了一種新的篩選模式。該傳感

4、器的制備方法簡單，改變功能化的內(nèi)核材料可以推廣到多種敏感染料的包埋，發(fā)展成為一種集成化的納米傳感器，實現(xiàn)多組分的同步分析，而且二氧化硅殼納米顆粒具有穩(wěn)定的理化性能、良好的生物相容性，因此基于硅殼納米顆粒發(fā)展的納米傳感器有望用于細胞內(nèi)多種生理生化變化的實時監(jiān)測。 2.利用微乳液法合成了包埋聯(lián)釕吡啶的硅殼熒光納米顆粒，通過溫和的EDC交聯(lián)法將生物配體修飾到納米顆粒上，構(gòu)建了一種新型的生物功能化的熒光標(biāo)記探針。EDC交聯(lián)法反應(yīng)條件溫和

5、，并能有效地保留修飾的生物配體的活性，同時通過基因工程的方法將陰性細胞進行熒光標(biāo)記，在大量陰性細胞存在的情況下，實現(xiàn)了在同一個顯微鏡視野下根據(jù)熒光分布來判斷新型熒光標(biāo)記探針特異性識別的準(zhǔn)確性，為體外細胞的特異識別提供了直觀的證據(jù)。在此基礎(chǔ)上，成功地將這種生物功能化的熒光探針用于外周血中肝癌細胞的識別。硅殼熒光納米顆粒具有良好的生物相容性、熒光信號強、光穩(wěn)定性好以及低毒性等優(yōu)點，這些都為癌細胞的超靈敏檢測提供了可能。這種基于熒光納米顆粒探

6、針的標(biāo)記方法有望用于生物體內(nèi)疾病的早期診斷、癌細胞的微轉(zhuǎn)移以及干細胞發(fā)育等研究領(lǐng)域。 3.首次利用氨基化硅殼納米顆粒(NH2SiNP)作為反義核酸載體開展了其在細胞水平上的應(yīng)用。通過反相微乳液技術(shù)利用硅烷化試劑的同步水解一步法制備了帶正電荷的氨基化硅殼納米顆粒NH2SiNP，它可以高效地結(jié)合帶負電荷的反義寡核苷酸(ODN)形成NH2SiNP-ODN復(fù)合物，并可以有效地保護ODN免受DNaseI的降解。通過熒光納米顆粒的熒光同步示

7、蹤作用發(fā)現(xiàn)NH2SiNP-ODN復(fù)合物可以很好地進入細胞，為開展細胞水平上的反義治療提供了保證。應(yīng)用于癌細胞的反義治療表明NH2SiNP可以提高ODN進入細胞的幾率，通過細胞存活率和蛋白表達水平兩個方面證明ODN在NH2SiNPs的輸送下其反義效果大大增加。與商品化的脂質(zhì)體相比，NH2SiNP具有與脂質(zhì)體相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染效率，在相同反義抑制效果的條件下，NH2SiNP的細胞毒性要比脂質(zhì)體小得多。因此NH2SiNP有望作為一種有應(yīng)用前景的反義核

8、酸載體用于癌細胞的反義治療。 4.發(fā)展了一種簡單易行的方法來制備和改善殼聚糖-DNA納米顆粒的性能。通過在殼聚糖與DNA體系中加入不同大小與電荷數(shù)的陰離子，利用殼聚糖與DNA之間以及殼聚糖與各陰離子之間的靜電吸引協(xié)同作用，控制殼聚糖的可控凝膠化，制備出大小均勻、分散性好的殼聚糖-DNA納米顆粒。陰離子加入后殼聚糖仍然具有對DNA的高包封率與強保護性，而且在不改變DNA高包封率的情況下，通過改變陰離子的種類與濃度可以控制顆粒表面的

9、ξ電勢。通過陰離子的可控凝膠化改善納米顆粒性能，方法簡單、條件溫和，為生物可降解型納米顆粒載體的發(fā)展提供一種新的研究模式，并可推廣到陽離子型聚合物材料納米顆粒型藥物或基因載體的研究領(lǐng)域中。 5.開展了硅殼納米顆粒與細胞相互作用及細胞吞噬硅殼納米顆粒生物學(xué)機制的基礎(chǔ)性研究。利用硅殼熒光納米顆粒的熒光信號同步指示作用，研究了細胞對表面電荷不同的硅殼納米顆粒的吞噬情況。發(fā)現(xiàn)細胞對硅殼納米顆粒的吞噬依賴于納米顆粒的初始濃度、表面電荷以及

10、與細胞培育時間的長短，培養(yǎng)基中的血清對細胞吞噬硅殼納米顆粒也有重要的影響。以HeLa細胞為研究對象探討了細胞吞噬硅殼納米顆粒的生物學(xué)機制，研究表明HeLa細胞吞噬硅殼納米顆粒需要能量參與，是一個依賴于納米顆粒初始濃度和培育時間并逐漸達到飽和的耗能過程，在液相內(nèi)吞和吸附內(nèi)吞二者共同的作用下完成；高滲透壓的蔗糖溶液、無K+緩沖液、微管蛋白抑制劑nocodazole都可以不同程度地抑制HeLa細胞對硅殼納米顆粒的吞噬。根據(jù)本章研究結(jié)果，我們可