補(bǔ)腎中藥血清對(duì)破骨細(xì)胞的生物學(xué)作用及OPG-OPGL與破骨細(xì)胞活性的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：1.探討補(bǔ)腎中藥(骨靈丸)血清的最優(yōu)提取方法；2.觀察補(bǔ)腎中藥血清對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響；3.探討補(bǔ)腎中藥血清對(duì)破骨細(xì)胞RANK基因表達(dá)水平的影響；4.探討補(bǔ)腎中藥對(duì)成骨-破骨細(xì)胞共育體系中護(hù)骨素/護(hù)骨素配體的蛋白及基因表達(dá)水平的影響及與破骨細(xì)胞活性的相關(guān)性。 方法：1.按處方配制補(bǔ)腎中藥，傳統(tǒng)方法熬煮中藥，水浴鍋濃縮至252ml，SD大鼠36只隨機(jī)分成空白組(生理鹽水2ml)、低劑量組(生藥1.77g/次)、

2、中劑量組(生藥3.54g/次)、高劑量組(生藥7.08g/次)，每日早晚2次灌胃，共3天，第4日末次灌胃后1小時(shí)采血，離心，吸取血清，大部分血清56℃，30分鐘滅活保存，部分用于干預(yù)成骨細(xì)胞試驗(yàn)；取SD胎鼠的頭蓋骨分離培養(yǎng)獲得純化的成骨細(xì)胞，使用MTT比色分析方法在酶標(biāo)儀上測(cè)試滅活前后血清干預(yù)的成骨細(xì)胞增殖情況，記錄每組A570值；對(duì)硝基苯磷酸鹽法(PNPP)測(cè)各組堿性磷酸酶活性，使用SPSS10.0軟件包的配對(duì)T檢驗(yàn)比較滅活前后血清對(duì)

3、成骨細(xì)胞生物學(xué)作用的差別; 2.取SD大鼠的胎鼠四肢骨分離培養(yǎng)破骨細(xì)胞(OC)，差異貼壁法獲得純度在95％以上的破骨細(xì)胞，分成低、中、高、空白對(duì)照四組，每組6孔，施加相應(yīng)濃度的補(bǔ)腎中藥血清，對(duì)照組采用無(wú)中藥血清，培養(yǎng)24小時(shí)，酶動(dòng)力學(xué)法測(cè)定培養(yǎng)上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性，甲苯胺藍(lán)染色骨吸收陷窩并在圖像分析儀下測(cè)定骨吸收陷窩的面積和數(shù)目，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析比較補(bǔ)腎中藥血清對(duì)破骨細(xì)胞生物學(xué)作用

4、的差別； 3.取SD大鼠的胎鼠四肢骨分離培養(yǎng)破骨細(xì)胞(OC)，差異貼壁法獲得純度在95％以上的破骨細(xì)胞，分成低、中、高、空白及陽(yáng)性對(duì)照5組，每組6孔，施加相應(yīng)濃度的補(bǔ)腎中藥血清，空白組采用無(wú)中藥血清，陽(yáng)性對(duì)照組使用17-β雌二醇，在培養(yǎng)的破骨細(xì)胞中施加不同濃度的補(bǔ)腎中藥血清培養(yǎng)24小時(shí)，收集破骨細(xì)胞使用TRIzol方法提取總RNA，使用DNAman軟件設(shè)計(jì)引物序列，RT-PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)片段，使用Hema凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)條

5、帶OD值，比較各組目標(biāo)帶與內(nèi)參的比值，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析反應(yīng)破骨細(xì)胞中RANKmRNA表達(dá)水平的變化； 4.取SD大鼠的胎鼠顱骨與四肢骨分別分離、培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，利用復(fù)合培養(yǎng)系統(tǒng)使二者生活在同一環(huán)境中，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；在復(fù)合培養(yǎng)體系中施加不同濃度的補(bǔ)腎中藥血清，并與空白組及雌激素組對(duì)照，培養(yǎng)24小時(shí)后收集成骨細(xì)胞，采用Westernblot方法及RT-PCR雜交法測(cè)定OB細(xì)胞中OPG/OPGL

6、蛋白的改變及基因表達(dá)的變化，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析反應(yīng)成骨細(xì)胞中OPG/OPGL蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化；酶動(dòng)力學(xué)法測(cè)定培養(yǎng)上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性，利用甲苯胺藍(lán)對(duì)骨吸收陷窩染色并在圖像分析儀下測(cè)定骨吸收陷窩的面積和數(shù)目，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析比較補(bǔ)腎中藥血清對(duì)共培體系中破骨細(xì)胞生物學(xué)作用的差別，最后使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)OPG/OPGL的比值與破骨細(xì)胞的活性關(guān)系

7、進(jìn)行相關(guān)分析。 結(jié)果：1.補(bǔ)腎中藥在末次灌胃后1小時(shí)達(dá)高峰，滅活前補(bǔ)腎中藥低、中、高濃度組及空白對(duì)照組A570(增殖率％)的值分別為(0.809±0.261)、(0.876±0.274)、(0.851±0.299)、(0.711±0.248)滅活后各組A570(增殖率％)的值分別為(0.669±0.179)、(0.751±0.211)、(0.725±0.209)、(0.454±0.154)，各組成骨細(xì)胞的增殖率、ALP的活性在滅

8、活前后的血清干預(yù)下有顯著性差異，P＜0.01，但滅活血清與對(duì)照組比較仍有明顯作用，P＜0.01； 2.單獨(dú)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞在加入補(bǔ)腎中藥血清后培養(yǎng)上清中TRAP活力低、中、高與空白對(duì)照組分別是(1.36±0.14)U/L、(1.29±0.18)U/L、(1.31±0.24)U/L、(1.75±0.14)U/L(補(bǔ)腎中藥組與對(duì)照組相比P＜0.01，補(bǔ)腎中藥組間比較P＞0.05)；骨吸收陷窩的面積低、中、高與空白對(duì)照組分別是(293.

9、23±190.45)μm2、(335.40±202.33)μm2、(365.70±189.47)μm2、(495.25±210.37)μm2(補(bǔ)腎中藥組與對(duì)照組相比，P＜0.01，補(bǔ)腎中藥組間比較P＞0.05)，骨吸收陷窩數(shù)目分別是(11.40±1.50)個(gè)、(12.50±1.80)個(gè)、(14.40±2.42)個(gè)、(18.40±2.32)個(gè)(補(bǔ)腎中藥組與對(duì)照組相比，P＜0.01，補(bǔ)腎中藥組間比較P＞0.05)； 3.RT-PCR

10、顯示，補(bǔ)腎中藥血清能下調(diào)破骨細(xì)胞中RANKmRNA的表達(dá)，低濃度的補(bǔ)腎中藥血清即可降低RANKmRNA表達(dá)，但無(wú)明顯劑量相關(guān)性(補(bǔ)腎中藥組與對(duì)照組相比，P值均小于0.05，補(bǔ)腎中藥組間比較P＞0.05)，E2下調(diào)RANKmRNA的表達(dá)更為明顯(P＜0.01)； 4.復(fù)合培養(yǎng)體系中Westernblotting及RT-PCR顯示：補(bǔ)腎中藥血清能上調(diào)成骨細(xì)胞中OPG蛋白及OPGmRNA的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞中OPGL蛋白及OPGLmRNA

11、的表達(dá)，低濃度即有效(與對(duì)照組吸光度相比P＜005)，不同中藥濃度組無(wú)明顯差異(P＞0.05)；E2上調(diào)成骨細(xì)胞中OPG蛋白及OPGmRNA降低OPGL蛋白及OPGLmRNA的表達(dá)最為明顯(與對(duì)照組吸光度相比P＜0.01)；補(bǔ)腎中藥血清能降低復(fù)合培養(yǎng)體系破骨細(xì)胞的TRAP的活力，減少骨磨片陷窩吸收面積(補(bǔ)腎中藥組與對(duì)照組相比，P值均小于0.05)，但亦無(wú)明顯劑量相關(guān)性，不同中藥濃度組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，E2下調(diào)TRAP活性及減少

12、骨磨片陷窩吸收面積更為明顯(P＜0.01)；統(tǒng)計(jì)學(xué)處理提示TRAP活力與骨磨片陷窩吸收面積服從正相關(guān)線性分布；骨磨片陷窩吸收面積和OPG/OPGL服從負(fù)相關(guān)線性分布。 結(jié)論：1.補(bǔ)腎中藥在末次灌胃后1小時(shí)采血此時(shí)的血清含藥物有效成分最高，滅活后血清能滿足試驗(yàn)要求； 2.補(bǔ)腎中藥血清可抑制體外單獨(dú)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞的骨吸收功能; 3.補(bǔ)腎中藥血清可抑制破骨細(xì)胞的RANK基因表達(dá)水平； 4.補(bǔ)腎中藥血清可抑制體外