敲低亮氨酰-tRNA合成酶表達(dá)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是臨床上最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常見(jiàn)、惡性程度最高的膠質(zhì)瘤。雖然在過(guò)去幾年膠質(zhì)瘤的研究取得了很大進(jìn)步，但惡性膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后仍然很差。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種多基因和多信號(hào)通路異常的疾病，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍不是很清楚。
　　近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酰-tRNA合成酶（leucyl-tRNA synthetase，LARS）除其催化亮氨酰-tRNA合成的

2、經(jīng)典功能外，還具有非經(jīng)典功能，是腫瘤相關(guān)基因。但LARS在膠質(zhì)瘤中的研究鮮有報(bào)道。MicroRNAs(miRs)是一類(lèi)小的非編碼RNA，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。研究表明miRs在多種腫瘤（包括膠質(zhì)瘤）中異常表達(dá)，扮演癌基因或抑癌基因的作用。目前尚不清楚LARS是否與miRs存在關(guān)系。
　　本課題研究的主要目的是探討LARS基因在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及miR-451與LARS基因表達(dá)關(guān)系，為揭開(kāi)膠質(zhì)瘤的

3、發(fā)病機(jī)制、開(kāi)拓新的治療策略和靶點(diǎn)提供線索。
　　第一部分應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)和蛋白印跡法(westernblot)檢測(cè)了9個(gè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和1例正常腦組織的LARS表達(dá)量，結(jié)果顯示LARS在9個(gè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和1例正常腦組織均有表達(dá)且在9個(gè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量明顯高于正常腦組織(P＜0.05)，PCR和western blot結(jié)果相一致。又運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)了LARS在含有75例膠質(zhì)瘤和5

4、例瘤旁正常腦組織的組織芯片中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LARS在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)要明顯高于在正常腦組織中的表達(dá)(P＜0.05)，與膠質(zhì)瘤級(jí)別成正相關(guān)，但相關(guān)程度不高(r=0.283，P＜0.05)，且Ⅰ/Ⅱ級(jí)和Ⅲ/Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤之間LARS表達(dá)差異不明顯(P＞0.05)。由此，我們得出結(jié)論LARS在人腦膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)，可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。
　　第二部分利用LARS小干擾RNA(LARS siR)技術(shù)探討了敲低LARS表達(dá)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

5、U251和SNB19生物學(xué)行為的影響及可能的機(jī)制。首先，利用real-time PCR和western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染LARS siR后LARS基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示LARS siR可以有效敲低LARS表達(dá)。緊接著敲低LARS表達(dá)后，利用MTT法分析了細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析了細(xì)胞群體依賴性和增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)分析了細(xì)胞周期分布，劃痕、transwell實(shí)驗(yàn)分析了細(xì)胞遷移侵襲能力，annexin-Ⅴ法檢測(cè)了

6、細(xì)胞凋亡率，western blot分析相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明敲低LARS表達(dá)抑制了惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力，阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期，降低了細(xì)胞遷移侵襲能力，下調(diào)了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1）信號(hào)通路的活性，但對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯的影響。由此，我們得出結(jié)論LARS基因可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過(guò)mTORC1信號(hào)通路扮演癌基因的作用，有望成為

7、治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)新的基因靶點(diǎn)。
　　第三部分利用人工合成寡核苷酸miR-451 mimics和miR-451 inhibitor探討了miR-451與LARS的靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示miR-451 mimics和inhibitor可以有效上調(diào)和下調(diào)miR-451在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，且與LARS蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。構(gòu)建LARS3，-UTR雙熒光素酶質(zhì)粒，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了miR-451調(diào)控LARS表達(dá)的機(jī)制:LARS是mi