腫瘤相關(guān)抗原CHP2對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、[研究背景和目的]：卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，但其發(fā)病機(jī)制還不十分明確，腫瘤特異/相關(guān)抗原的鑒定、分離及其生物學(xué)功能的探討是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)方向之一。CHP2(Calcineurin homologous protein 2)是最近從肝細(xì)胞性肝癌中篩選出的腫瘤相關(guān)抗原，可表達(dá)于某些腫瘤如肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌及白血病等組織細(xì)胞，而在相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞中沒有檢測到表達(dá)，其生物學(xué)功能目前尚不清楚。本研究旨在探討CHP2在卵巢癌細(xì)

2、胞中的表達(dá)狀況及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 [方法]： 1、CHP2在卵巢癌組織中的表達(dá)：應(yīng)用RT-PCR法測定20例正常人卵巢組織和20例卵巢上皮癌組織中CHP2 mRNA的表達(dá)。 2、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：構(gòu)建pEGFP-N1-CHP2表達(dá)載體，并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入OVCAR3細(xì)胞中，并篩選出穩(wěn)定克隆。實(shí)驗(yàn)分為3組，CHP2基因轉(zhuǎn)染組(OVCAR3/CHP2組)、空載體轉(zhuǎn)染組(OVC

3、AR3/Neo組)和空白對(duì)照組(OVCAR3組)。 3、CHP2和Na+/H+exchanger isoform 1(NHE1)在OVCAR3細(xì)胞中表達(dá)的鑒定：利用RT-PCR技術(shù)檢測OVCAR3細(xì)胞中CHP2和NHE1轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。用熒光顯微鏡下觀察的方法檢測3組細(xì)胞中CHP2綠色熒光融合蛋白水平的表達(dá)。 4、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長期的OVCAR3/CHP2、OVCAR3/neo和OVCAR3以相同數(shù)量接種后應(yīng)

4、用細(xì)胞活力儀每隔12小時(shí)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)繪制生長曲線。 5、粘附實(shí)驗(yàn)：與上述相同辦法分組及制備細(xì)胞，分別于15 min、30 min 60 min，或90min．用細(xì)胞活力儀分別計(jì)數(shù)上清中和貼附的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞粘附率。 6、劃痕實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞以相同數(shù)量接種于預(yù)先包被有FN (Fibronectin)的6孔培養(yǎng)板上，單層細(xì)胞表面劃出一條橫行無細(xì)胞刮除帶，相差顯微鏡下照相(10倍)并測量劃痕的寬度(Oh)，36小時(shí)后，以相同

5、的方法照相、測量。將0h劃痕兩端的距離設(shè)為100﹪，計(jì)算各組細(xì)胞在培養(yǎng)36h后的劃痕區(qū)域占0h劃痕區(qū)域的百分比。 7、侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwcll小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測CHP2基因轉(zhuǎn)染前后穿透人工重組基底膜的能力。將細(xì)胞以相同數(shù)量接種于包被有Matrigel基質(zhì)膠的小室上室，下室加入無血清的鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3上清培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h，40倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)。 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS11.

6、5軟件包，CHP2在卵巢癌組織中的表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用，檢驗(yàn)，p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余實(shí)驗(yàn)應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)配合q檢驗(yàn)(Newman-Keuls)進(jìn)行比較，p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1、CHP2：在卵巢癌組織中的表達(dá)：20例卵巢癌組織CHP2 mRNA陽性表達(dá)17例，而在20例正常卵巢組織中僅1例表達(dá)陽性。CHP2在卵巢癌組織的表達(dá)率顯著增高(<'2>=25.86，p<0.05)

7、。 2、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：成功構(gòu)建了CHP2基因真核表達(dá)載體并建立了穩(wěn)定表達(dá)CHP2的細(xì)胞株OVCAR3/CHP2。 3、CHP2和NHEl在OVCAR3細(xì)胞中表達(dá)的鑒定：在未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的OVCAR3細(xì)胞中沒有檢測到CHP2的表達(dá)，在pEGFP-N1-CHP2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后OVCAR3細(xì)胞中有CHP2的高表達(dá)。在OVCAR3細(xì)胞中有NHEl的強(qiáng)表達(dá)，而且在轉(zhuǎn)染前后沒有改變。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)EGFP/CHP2融合蛋

8、白主要表達(dá)于胞漿近膜區(qū)，而在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組EGFP則廣泛表達(dá)于整個(gè)細(xì)胞。 4、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)：OVCAR3/CHP2組細(xì)胞的生長速度較OVCAR3/Neo和OVCAR3組增快(p<0.05)，粘附能力也較后兩組增強(qiáng)(P<0.05)。OVCAR3/CHP2組細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)中的遷移能力和在侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過人工基底膜的侵襲能力均較OVCAR3/Neo和OVCAR3組明顯增強(qiáng)，分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。