手足口病重要病毒序列分析及生物信息學表征.pdf

1、目的：手足口病是一種流行性傳染病，多由腸道病毒引起，癥狀主要表現(xiàn)為手、足和口腔粘膜的皰疹，多數(shù)是良性、自限性疾病，也可出現(xiàn)心、肺和神經(jīng)系統(tǒng)等嚴重并發(fā)癥。我們利用對腸道病毒具有較高特異性的兼并引物和自行設計的分型引物，檢測手足口病患兒咽拭子標本，同時，通過腸道病毒基因組VP1編碼區(qū)序列的測定和分析，研究手足口病病原體檢測和分型方法，掌握其遺傳進化特征。人類腸道病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，該屬包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《竞?/p>

2、腸道病毒，其中腸道病毒71型是引起手足口病最重要的病原體，由其引起的手足口病癥狀較重，常伴有無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等并發(fā)癥，嚴重者甚至會導致死亡。該病毒存在較明顯的變異和重組現(xiàn)象，因此到目前為止仍沒有很好的預防和治療方法。本課題通過對腸道病毒71型VP1區(qū)序列及全基因組序列的分析，研究腸道病毒71型的變異、重組規(guī)律，為疫苗的研發(fā)、藥物靶位的篩選及防控策略的完善等提供理論基礎。除柯薩奇病毒A16(CVA16)和腸道病毒7

3、1型(EV71)以外，柯薩奇病毒A10(CVA10)、柯薩奇病毒A6(CVA6)也是手足口病比較常見的病原體。本課題通過對手足口病CVA10 VP1蛋白的生物信息學研究，分析和預測該病毒VP1蛋白的理化特性、空間結構以及該蛋白的B細胞抗原表位。
　　 方法：⑴標本采集自山東大學齊魯兒童醫(yī)院住院手足口病患兒的咽拭子標本。標本加入適當生理鹽水，劇烈振蕩洗下咽拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，自然沉淀后吸取上清液，加入適量抗生素，置

4、4℃條件下，備用。⑵采用北京天根公司病毒RNA提取試劑盒，按說明書進行。提取的RNA溶于60ulRnase-free ddH2O中，直接用于RT-PCR或置-20℃以下低溫保存。⑶用腸道病毒通用實時熒光RT-PCR核酸檢測試劑盒同時分別進行腸道病毒屬、EV71和CVA16型進行分子鑒定。⑷合成對腸道病毒VP1區(qū)3’端序列具有較高特異性的兼并引物040-011，同時通過檢索GenBank中EV71和CVA10病毒基因型VP1序列，分別設計

5、分型引物。⑸通過RT-PCR方法擴增EV71、CVA16、CVA6和CVA10病毒基因型VP1區(qū)核苷酸序列。⑹瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分離，利用北京天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對DNA進行回收、純化。⑺回收后的DNA進行序列測定。采用生物信息學軟件DNAMAN5.2.2和BioEdit7.0.9.0進行序列比對并構建系統(tǒng)進化樹。⑻使用基因重組分析軟件RDP和Simplot＿v3.5.1，對EV71基因組進行重組分析。⑼利用R4

6、(Gamier-Osguthorpe-Robson方法)、HNN(Hierarchical人工神經(jīng)網(wǎng)絡預測法)、PHD(多重比對人工神經(jīng)網(wǎng)絡比對預測結構法)、Predator(單序列分析人工神經(jīng)網(wǎng)絡預測結構法)、SOPMA(改進型自我優(yōu)化預測結構法)等方法預測VP1蛋白的二級結構(無規(guī)卷曲、β-片層、β-螺旋和β-轉角)。⑽利用Expasy(http：//au.Expasy.org/tools/)中的SWISS-MODEL三級結構同源建

7、模，預測VP1蛋白的空間構象并建模。⑾應用DNAstar軟件的Protean，采用Kyte-Doolittle、Karplus-Schultz、Emini和Jameson-Wolf對氨基酸的親水性、柔韌性、表面可能性及抗原指數(shù)進行單參數(shù)分析。⑿用ABCpred和DiscoTope服務器預測B細胞表位。將單參數(shù)預測結果匯總，結合二級結構中無規(guī)卷曲區(qū)域確定為B細胞優(yōu)勢表位。最后采用ABCpred和DiscoTope驗證表位預測結果。

8、　　 結果：①5個EV71濟南分離株核苷酸同源性為95.7％-99.1％，氨基酸同源性為98.7％-100％。在進化關系上，它們與EV71 C4a亞型的同源性較高，核苷酸同源性為90.8％-98.8％，故而屬于C4a亞型。②2個CVA16濟南分離株核苷酸和氨基酸同源性較高，分別為97.7％和96.8％。它們與CVA16 B1b亞型的同源性較高，核苷酸和氨基酸的同源性分別為90.5％-95.5％和96.8％-100％。JN-C07和JN

9、-B11與大部分毒株相比，無氨基酸變異位點出現(xiàn)。③39份腸道病毒通用型陽性非EV71、非CVA16標本，用040-011引物擴增后，有5例為CVA10，1例為CVA6。其余33份樣本的腸道病毒血清型待定。④利用自行設計的CVA10分型引物P16、P11.2擴增上述33份血清型待定的標本，其中4份標本確定CVA10，核苷酸同源性為94.5％-99.0％，氨基酸同源性為97.2％-99.5％。⑤在線Blast程序比對，JN-D04屬于CVA

10、6型，與2003年，2009年報告的12個CVA6毒株核苷酸同源性為75.1％-92.3％，同源性最高的是臺灣2008年的EU908152，氨基酸同源性為82.0％-89.0％；氨基酸在767、773、776、777、792、806、812、824、827、841、843和845位發(fā)生變異。⑥2010年濟南市2個病毒株在P1區(qū)與EV71 C型具有較高相似度(Simplot圖中顯示相似度>80％)，在2B-3B區(qū)之間與B基因型相似度較高(

11、>75％)。3’末端這兩個病毒株與EV71各基因型代表株的相似度均不高(<75％)，而在3C到3’UTR區(qū)與CVA16 G-10相似較高(>75％)。⑦JN-C10與CVA10 D型基因組同源性最高，核苷酸和氨基酸的同源性分別為91.5％-97.6％和90.4％-98.6％。測序所得VP1基因長為732個核苷酸，其相對分子質(zhì)量為60580，理論等電點為5.10。VP1蛋白二級結構中以無規(guī)卷曲為主，無跨膜區(qū)域，屬于胞外蛋白。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)

12、庫(PDB)一個已知結構的蛋白質(zhì)(編號為3vbhA)與VP1具有65％的序列一致性，并以此為模板，得到VP1蛋白三級結構模型。最后，綜合多種抗原表位分析方法得出，JN-C10 VP1蛋白的B細胞抗原表位可能是12-23、100-110、115-125、169-180、195-215及220-2385個區(qū)段。
　　 結論：⑴兼并引物040-011對HEVA類腸道病毒VP1區(qū)3’端具有較高的特異性。⑵引起手足口病的腸道病毒，除EV7

13、1和CVA16外，CVA10和CVA6也是其常見病原體。⑶CVA10能引起重癥手足口病和病毒性腦炎、癲癇等嚴重的臨床表現(xiàn)。⑷2010年-2011年濟南EV71分離株為C4a亞型，CVA16分離株為B1b亞型，CVA10分離株為D基因型，與近幾年中國大陸各基因型優(yōu)勢株流行趨勢基本一致。⑸2010年EV71濟南分離株存在基因型內(nèi)和型間雙重組現(xiàn)象。⑹CVA10 VP1基因編碼蛋白存在多個抗原表位區(qū)域，可能是免疫診斷、藥物作用和疫苗研制的靶位，