沉默SEPT9基因?qū)θ烁伟㎝HCC97-H細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的:根據(jù)SEPT9基因序列設(shè)計并合成相應(yīng)SEPT9-siRNA,探討SEPT9-siRNA對人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H細(xì)胞生長特異性抑制作用及其凋亡的影響,進(jìn)一步揭示SEPT9基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　方法:根據(jù)SEPT9基因核苷酸序列設(shè)計4對針對SEPT9基因的靶序列,由生物公司構(gòu)建4個針對SEPT9基因的siRNA,同時構(gòu)建不針對任何基因的帶有綠色熒光蛋白基因的siRNA,預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出一個有效siRNA,其靶序

2、列為GGCAGCCCATCATGAAGTTCA。培養(yǎng)MHCC97-H細(xì)胞,待細(xì)胞生長狀態(tài)良好并達(dá)到指數(shù)生長期時,于轉(zhuǎn)染前一日接種于6孔板(CCK-8法檢測MHCC97-H細(xì)胞生長抑制情況用96孔板接種),設(shè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白組。以每孔脂質(zhì)體LipofectamineTM20007.5ug,重組siRNA3ug配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,加入各孔MHCC97-H細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染(空白組不加任何試劑)。轉(zhuǎn)染后48h熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞所占比

3、例,判斷轉(zhuǎn)染效率。①RT-PCR法檢測SEPT9mRNA的表達(dá)抑制情況:轉(zhuǎn)染后48h,提取各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳,最后凝膠成像分析系統(tǒng)吸光度掃描觀察結(jié)果。②用westernblot法檢測SEPT9蛋白質(zhì)的表達(dá)抑制情況:轉(zhuǎn)染后48h,提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,以GAPDH蛋白為內(nèi)對照進(jìn)行SDS-PAGE電泳,半干法轉(zhuǎn)膜,一抗、二抗雜交孵育,化學(xué)發(fā)光液顯影并用紫外凝膠成像分析

4、系統(tǒng)自動曝光,結(jié)果用凝膠成像儀掃描QuantityOne4.4.0軟件分析,檢測各組SEPT9蛋白的相對表達(dá)量。③以0h、24h、48h、72h為時間點(diǎn),用CCK-8法檢測SEPT9-siRNA對細(xì)胞生長抑制的影響。④轉(zhuǎn)染后48h用流式細(xì)胞技術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測各組MHCC97-H細(xì)胞凋亡率。⑤細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組MHCC97-H細(xì)胞0h、24h、48h、72h的遷移率。
　　結(jié)果:①轉(zhuǎn)染后48h熒光顯微鏡

5、下觀察,根據(jù)發(fā)綠色熒光的MHCC97-H細(xì)胞所占比率判斷LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染MHCC97-H細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)75％以上。②RT-PCR法檢測結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組SEPT9條帶亮度明顯弱于兩對照組,灰度掃描半定量結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組MHCC97-H細(xì)胞中SEPT9mRNA表達(dá)水平顯著底于兩對照組。③免疫印跡分析顯示:各組內(nèi)對照GAPDH蛋白條帶的亮度相似,而septin-9蛋白條帶亮度實(shí)驗(yàn)組明顯弱于其它兩組。QuantityO

6、ne4.4.0軟件分析結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白組septin-9蛋白的相對表達(dá)量分別為0.448±0.044、1.844±0.047、1.876±0.036。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)方差分析,實(shí)驗(yàn)組septin-9蛋白相對表達(dá)量分別與空白組及陰性對照組相比,均下降76%左右,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而其它兩組之間相比,無顯著性差異(P>0.05)。④CCK-8法檢測結(jié)果顯示;在0h~72h范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)組與空白組、陰性對照組的

7、OD值相比較,差異具有顯著性(P<0.01),其它兩組之間相比,無顯著性差異(P>0.05);表明SEPT9-siRNA對MHCC97-H細(xì)胞生長有明顯抑制作用。⑤流式細(xì)胞儀檢測顯示:空白對照組、陰性對照組、實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染72h細(xì)胞凋亡率分別為(28.28±3.45)%、(5.65±1.56)%、(5.33±1.81)%,經(jīng)q檢驗(yàn)方差分析,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后12h細(xì)胞凋亡率即開始升高(P﹤0.01),隨后逐漸升高,72h凋亡率達(dá)到最高,而陰性對照

8、組較空白對照組無顯著差異(P﹥0.05)。⑥細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,與空白對照組和陰性對照組相比,實(shí)驗(yàn)組劃痕寬度明顯縮小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),空白對照組和陰性對照組兩者間劃痕寬度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:1.針對SEPT9基因的RNAi靶序列設(shè)計有效;合成的siRNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法能高效轉(zhuǎn)染MHCC97-H細(xì)胞,并有效抑制MHCC97-H細(xì)胞中相應(yīng)基因的表達(dá)。2.靶向SEPT9的siRNA能顯