HMGB1對人角膜緣上皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、角膜炎癥是眼科最常見的疾病之一，而復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在角膜炎癥中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。因此，關(guān)于細(xì)胞因子的研究對揭示角膜炎癥的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療干預(yù)靶點(diǎn)具有非常重要的意義。高遷移率族蛋白1(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質(zhì)，它既是炎癥的早期啟動者(HMGB1從壞死細(xì)胞的被動釋放)，又是炎癥晚期的促進(jìn)者(巨噬細(xì)胞主動分泌HMGB1)，然而，目前我們尚未發(fā)現(xiàn)HMGB1在眼表疾病的相關(guān)研究。此外，胞外HMGB1需與相應(yīng)胞膜受體結(jié)合才能發(fā)揮

2、其生物學(xué)效應(yīng)。HMGB1已知的受體包括晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、TOLL樣受體(TLR)2及4，其中TLR2和TLR4受體在角膜上皮細(xì)胞的表達(dá)已有報(bào)道，但目前尚無角膜上皮細(xì)胞表達(dá)RAGE受體的相關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的在于探討角膜緣上皮細(xì)胞是否存在RAGE受體的表達(dá)，及HMGB1是否對角膜緣上皮細(xì)胞存在生物學(xué)效應(yīng)。
　　 本研究首先建立人角膜緣上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，探討角膜緣上皮細(xì)胞是否存在RAGE受體的表達(dá)。我們收

3、集了角膜移植術(shù)后的角鞏膜環(huán)，分別使用CnT20和DMEM全培養(yǎng)基，采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜緣上皮細(xì)胞，并對第三代細(xì)胞采用免疫熒光法進(jìn)行AE5的鑒定。然后通過免疫熒光法和RT-PCR技術(shù)對正常角膜組織的冰凍切片和培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行RAGE受體表達(dá)的檢測。我們發(fā)現(xiàn)與DMEM全培養(yǎng)基相比，CnT20無血清培養(yǎng)基更有利于角膜緣上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)。并且，CnT20無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第三代角膜緣上皮細(xì)胞存在角蛋白3的表達(dá)，證實(shí)了培養(yǎng)的細(xì)胞為角膜上皮細(xì)胞來

4、源，因此可以用于本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究。同時(shí)，免疫熒光和RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證角膜緣上皮細(xì)胞有RAGE受體的陽性表達(dá)，主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，為HMGB1對角膜緣上皮細(xì)胞存在生物學(xué)效應(yīng)的猜想提供生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 然后，本研究從細(xì)胞增殖、凋亡、遷移三方面研究HMGB1對角膜緣上皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。我們采用CCK8法檢測HMGB1對角膜緣上皮細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀、共聚焦熒光顯微鏡檢測HMGB1對角膜緣上皮細(xì)胞凋亡的影響；采用劃痕實(shí)驗(yàn)

5、探討HMGB1對角膜緣上皮細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1對角膜緣上皮的增殖和遷移存在雙向調(diào)節(jié)作用，即低濃度時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，而高濃度時(shí)表現(xiàn)為抑制作用。此外，HMGB1對角膜緣上皮的凋亡存在明顯的促進(jìn)作用。上述結(jié)果表明高濃度的HMGB1能抑制角膜緣上皮細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，因此不利于角膜上皮的修復(fù)，延緩角膜上皮的愈合，可導(dǎo)致炎癥的遷延不愈。
　　 最后，本研究探討了HMGB1對角膜緣上皮細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響。通

6、過免疫熒光和ELISA技術(shù)，我們初步發(fā)現(xiàn)HMGB1可以促進(jìn)VEGF、NFkappaB、TNF-α、IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)NFkappaB的核轉(zhuǎn)位。這說明HMGB1可能通過調(diào)控炎癥因子和促新生血管因子的表達(dá)而參與角膜炎癥的發(fā)生發(fā)展，因此有可能是干預(yù)角膜炎癥的一個(gè)治療靶點(diǎn)。
　　 綜上所述，本研究首次驗(yàn)證了角膜緣上皮細(xì)胞存在RAGE受體的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)HMGB1參與了角膜緣上皮細(xì)胞的增殖、凋亡、移行及細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)。本研究揭示了H