鋸緣青蟹免疫增強(qiáng)劑的篩選及在病害防控中的應(yīng)用.pdf

1、鋸緣青蟹(Scylla serrata)是我國主要的海水甲殼類養(yǎng)殖品種，總產(chǎn)量達(dá)到10.85萬噸，占世界總養(yǎng)殖產(chǎn)量的88.14％。近年來養(yǎng)殖鋸緣青蟹發(fā)生大規(guī)模疾病和死亡。青蟹發(fā)生的疾病有黃水病、弧菌病、纖毛蟲病、自芒病、褐斑病、黃斑病等，病原包括細(xì)菌、病毒、環(huán)境因素及不明病因的疾病。2006年青蟹全國平均發(fā)病率為13.77％左右，全年經(jīng)濟(jì)損失為2.29億元，嚴(yán)重制約了青蟹養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展。
　　 作者研究了溫度、pH、促進(jìn)劑、

2、抑制劑、菌體及免疫多糖對鋸緣青蟹血細(xì)胞裂解物(HLS)酚氧化酶(phenoloxidase，PO)活力的影響。試驗結(jié)果表明：鋸緣青蟹PO的最適作用溫度為25℃，最適pH值為7.8；SDS、Ca2+、Mg2+均可提高PO的活力，其中Ca2+和Mg2+的最佳反應(yīng)濃度分別為50 mmol/L和150 mmol/L，SDS的最佳反應(yīng)濃度為2.5 mg/mL；疊氮鈉、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、乙二胺四乙酸、Cu2+對PO活力有不同的抑制作用。發(fā)現(xiàn)擬

3、態(tài)弧菌SS060818、氣單胞菌MrM0602、金黃色葡萄球菌ATCC25923、溶壁微球菌AS1.634對PO有激活作用，其中擬態(tài)弧菌和氣單胞菌激活作用顯著，金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌對PO有弱激活作用；肽聚糖、擬態(tài)弧菌脂多糖粗提物可顯著提高PO活力，肽聚糖、脂多糖的最佳激活濃度2.7 mg/mL、0.5 mg/mL。此外，建立了超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、吞噬等青蟹非特異性免疫指標(biāo)的測定方法。
　　 通過酚氧化酶體外增強(qiáng)試驗

4、，開展了青蟹免疫增強(qiáng)的篩選試驗。選擇了30多種中草藥和食用菌，提取其免疫多糖，測定了免疫多糖對青蟹血淋巴酚氧化酶(PO)的增強(qiáng)作用。結(jié)果表明白術(shù)多糖、木耳多糖、金銀花多糖、大黃多糖、豬苓多糖、陳皮多糖、CIS-1、CIS-2等均可顯著提高PO活力，其最佳激活濃度范圍為0.03125μg/mL-0.125 mg/mL，其他多糖對PO促進(jìn)作用較弱或無作用。選擇CIS-1、CIS-2、連翹多糖分別以7.5×10-3mg/mL、0.031 mg

5、/mL和1.25×10-4mg/mL對鋸緣青蟹進(jìn)行免疫注射實驗，定期測定青蟹血淋巴的超氧化物岐化酶(SOD)、堿性磷酸酶(ALP)、過氧化物酶(POD)、酚氧化酶(PO)、血清抗菌活力和血細(xì)胞吞噬活力等指標(biāo)。CIS-1、CIS-2、連翹多糖注射后，青蟹過氧化物酶(POD)、酚氧化酶(PO)活力和血細(xì)胞吞噬活性比對照組均有不同程度的提高；注射CIS-124h后，血淋巴SOD活性比對照提高了18.2％(由12.76 U/mgprot提高到1

6、5.08U/mgprot)，ALP比對照組提高了75％(0.52 U/mL提高到0.91U/mL)；青蟹注射CIS-2和連翹多糖后，血淋巴SOD和ALP活性無明顯提高。青蟹注射免疫多糖后，連翹多糖的抗菌活力未見明顯提高，表明上連翹多糖對青蟹血清抗菌活力無明顯增強(qiáng)作用。青蟹注射免疫多糖后，各組養(yǎng)殖箱中投入青蟹有較強(qiáng)致病力的擬態(tài)弧菌SS060818(V.minicus)，終濃度為1×107cfu/mL。試驗表明，注射CIS-1、CIS-2、

7、連翹多糖組青蟹平均存活期比對照組分別增長55.92％、139.35％、12.43％。表明免疫多糖可提高青蟹對擬態(tài)弧菌的抵抗力。
　　 根據(jù)鋸緣青蟹免疫增強(qiáng)劑注射試驗結(jié)果，選擇能顯著提高鋸緣青蟹免疫指標(biāo)和存活率的CIS-1、CIS-2、PG、LPS作為免疫增強(qiáng)劑添加到飼料投喂青蟹，結(jié)果表明：投喂CIS-1、CIS-2、PG、LPS后，青蟹血淋巴過氧化物酶、酚氧化酶、堿性磷酸酶活力比對照組均有不同程度的提高；CIS-2試驗組第6d

8、ALP、POD和PO活力顯著高于對照組，其中ALP活力達(dá)0.74U/mL，比對照提高155％；SOD活力第11d比對照提高了180％，顯著高于對照組；投喂CIS-1和PG后青蟹血清中ALP活力在11d達(dá)到最高值，投喂PG、LPS第15d血清中的SOD活力顯著高于對照組；各免疫組血清抗菌活力在第6d達(dá)到最大值，但差異不顯著。投喂免疫多糖20d后，投入青蟹有較強(qiáng)致病力的擬態(tài)弧菌SS060818(V.minicus)，終濃度為1×107cfu

9、/mL感染青蟹，投喂CIS-1、CIS-2、PG、LPS組青蟹平均存活期比對照組分別增長了44.57％、104.51％、31.59％、78.70％，表明免疫多糖可提高青蟹對擬態(tài)弧菌的抵抗力。
　　 鋸緣青蟹越冬養(yǎng)殖用CIS-1、CIS-2、PG、LPS注射免疫鋸緣青蟹，測定青蟹血淋巴中ALP，SOD，PO，POD，血清抗菌活力等指標(biāo)，結(jié)果表明：試驗組ALP活力均高于對照組，其中以CIS-2效果最好，SOD、POD和PO的活力最高

10、值分別可達(dá)18.55U/mgprot、0.16 U/mL和38.16U/mL，分別比對照提高了50％、100％、176％，ALP活力仍處于較高水平；注射CIS-1和LPS的POD活力都在16d達(dá)到最高值為0.14 U/mL，比對照提高75％，作用效果顯著；注射LPS后血清中ALP、PO活力在與對照組相比變化不明顯；越冬45d后計算各試驗組青蟹存活率，CIS-1、CIS-2、PG存活率分別為73％、82％、70％，均高于對照組。