siRNA干擾TGFBR3對膀胱癌T24細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景與目的：
　　背景：研究表明TGFBR3在人類多種腫瘤中表達異常，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本課題組前期研究顯示：在膀胱癌組織中，TGFBR3表達異常，可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但其在膀胱癌細胞中的表達及其對膀胱癌生物學(xué)行為的影響還未見相關(guān)報道。
　　目的：本實驗通過檢測及siRNA干擾TGFBR3在膀胱癌細胞中的表達，進而研究其對膀胱癌生物學(xué)行為的影響。
　　方法：利用qRT-PCR及Western Bl

2、otting檢測正常膀胱上皮細胞株SV-HUC-1、膀胱癌細胞株5637及T24中TGFBR3的表達，篩選出高表達TGFBR3的細胞株。使用化學(xué)合成的siRNA干擾高表達TGFBR3的細胞株，并進行體外實驗觀察TGFBR3對膀胱癌生物學(xué)行為的影響。設(shè)計并合成四對特異性干擾TGFBR3的siRNA，利用qRT-PCR篩選出可以有效干擾TGFBR3 mRNA達75%以上的序列，進行后續(xù)實驗。應(yīng)用WST-1細胞增殖實驗及平板克隆形成實驗研究干

3、擾TGFBR3后膀胱癌細胞生長及活性的變化，選擇PI染色法研究干擾TGFBR3后膀胱癌細胞細胞周期分布的變化，進行劃痕實驗及Transwell遷移、侵襲實驗研究干擾TGFBR3后膀胱癌細胞運動、遷移、侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：本組PCR及Western Blotting實驗：無論在mRNA水平還是在蛋白水平，TGFBR3在三株細胞中的表達為：T24最高，SV-HUC-1其次，5637最低。三者mRNA表達量分別為3.420±0.

4、0875、1.000±0.1800、0.620±0.1270(P＜0.05)。因此選用T24細胞作為后續(xù)RNAi的工具細胞。設(shè)計合成的四對siRNA-R3-1-4均可以降低T24細胞TGFBR3的表達，干擾效率分別為：85.48%、89.37%、79.83%、68.78%(P＜0.001)。因此選擇siRNA-R3-1-3用于后續(xù)實驗。WST-1結(jié)果顯示：與Mock組、siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染后48h時，siRNA-TGFBR3組細

5、胞的生長及活性降低（P＜0.01），72h時兩者差異進一步增大（P＜0.001）。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示：與Mock組、siRNA-NC組相比，siRNA-TGFBR3組克隆形成數(shù)明顯減少（P＜0.05）。碘化丙啶染色實驗結(jié)果表明：siRNA-TGFBR3組與siRNA-NC組細胞周期分布相似，未見明顯sub-G1峰。劃痕實驗結(jié)果說明：siRNA-TGFBR3組較siRNA-NC組細胞運動能力減弱。進一步的Transwell遷移侵襲實

6、驗顯示：siRNA-NC、siRNA-TGFBR3兩組遷移到下室的每視野細胞數(shù)分別為258.0±12.5個、62.7±6.0個（P＜0.001），siRNA-NC、siRNA-TGFBR3兩組侵襲到下室的每視野細胞數(shù)分別為158.4±20.8個、20.3±8.5個（P＜0.001）。
　　結(jié)論:
　　1.本實驗明確顯示TGFBR3在膀胱癌細胞株中的表達情況，TGFBR3在5637細胞中表達較SV-HUC-1低，而在T24細胞