Hfgl2在肝癌和慢性病毒性肝炎中的作用及其免疫學(xué)機制研究.pdf

1、研究背景:
　　慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的一個全球性的健康問題。全世界約有3.5億人為HBV慢性感染者,每年約有100-200萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。我國是HBV感染高發(fā)地區(qū),人群攜帶率約9～10％。在CHB基礎(chǔ)上的重癥化病情篤重,發(fā)展迅猛,臨床上缺乏特異、有效的治療手段,除非實施緊急肝移

2、植,絕大部分患者預(yù)后不良。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)指出,每年共有43萬新發(fā)肝癌病例,其中3/4的病例發(fā)生在東南亞地區(qū)(包括中國、朝鮮和日本)。我國肝癌的分布與HBV的感染密切相關(guān),臨床上約有80％的肝癌患者體內(nèi)可檢測到HBV的感染。肝癌的惡性程度高,生存時間短,死亡率高,臨床治療方法也極為有限。肝癌及CHB的發(fā)病機制較為復(fù)雜,至今尚未完全闡明。目前認(rèn)為一定條件下宿主的免疫反應(yīng)異常是上述疾病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相關(guān)問題的闡明不僅有助于揭示肝癌及慢性乙

3、型肝炎的發(fā)病機制,也可為疾病的防治及預(yù)后評估提供新的靶點。
　　在20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn) FGL2/纖維介素蛋白( Fibrinogen-like protein2(fgl2)/fibroleukin)屬纖維介素相關(guān)蛋白超家族,又稱fgl2凝血酶原酶或跨膜型fgl2(membrane fgl2, mfgl2)。mfgl2可表達(dá)在巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上,具有絲氨酸蛋白酶活性,直接催化凝血酶原轉(zhuǎn)變成有活性的凝血酶,從而快速啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)

4、。國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn),mfgl2在一些以微循環(huán)障礙為病理生理特征的疾病模型,如暴發(fā)性病毒性肝炎、自發(fā)性流產(chǎn)、同種及異種移植排斥反應(yīng)中表達(dá)升高。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),mfgl2在多種惡性實體腫瘤(如結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌)中有較為廣泛的表達(dá),主要分布在惡性腫瘤的實質(zhì)細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)浸潤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上,并且其表達(dá)部位與纖維蛋白沉積具有明顯相關(guān)性。近期,我們又發(fā)現(xiàn)高表達(dá)mfgl2可促進(jìn)HCC嫁接瘤生長及血管的新生,同時證

5、實mfgl2的表達(dá)可活化高侵襲性肝癌細(xì)胞系HCCLM6細(xì)胞中MAPK途徑。這些現(xiàn)象提示mfgl2可通過MAPK途徑促進(jìn)腫瘤的生長和血管新生。
　　fgl2還有另外一種表達(dá)類型即可溶性fgl2(Soluble fgl2,sfgl2)。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)sfgl2可由Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分泌并參與機體免疫調(diào)節(jié)功能,同時通過fgl2-FcγRIIB受體途徑抑制T細(xì)胞的增殖和骨髓樹突狀細(xì)胞的成熟。在自身免疫性疾病小鼠模型中

6、發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過分泌sfgl2參與自身免疫性疾病的發(fā)展,并且發(fā)現(xiàn)sfgl2是構(gòu)成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能的重要分子。還有研究表明在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染的慢性丙型肝炎患者血漿中sfgl2的表達(dá)水平明顯高于健康人和非活動性酒精性肝硬化患者。
　　研究目的:
　　1.深入闡明 mfgl2通過 MAPK途徑促進(jìn)肝癌生長、侵襲和血管新生機制,進(jìn)一步揭示 mfgl2在腫瘤中的免疫學(xué)作用。

7、r>　　2.探討 sfgl2在 CHB患者中免疫調(diào)節(jié)機制。
　　研究方法:
　　1.mfgl2促進(jìn)肝癌細(xì)胞系 HCCLM6嫁接瘤生長,侵襲和血管發(fā)生機制的研究
　　1)通過免疫組織化學(xué)染色,檢測15例人高中低分化肝癌切片中fgl2的表達(dá),連續(xù)切片染色檢測 fgl2與纖維蛋白沉積的關(guān)系;
　　2)用RNA干擾技術(shù)建立fgl2敲除的人高侵襲性肝癌細(xì)胞系HCCLM6細(xì)胞模型;
　　3)利用瞬時電轉(zhuǎn)建立高表達(dá) fg

8、l2的肝癌細(xì)胞系 HCCLM6細(xì)胞模型;
　　4)用RT- PCR方法檢測人高侵襲性肝癌細(xì)胞(HCCLM6)人纖維介素(hfgl2),蛋白激活受體(PAR1,PAR2,PAR3,PAR4)mRNA水平的表達(dá),在基因水平鑒定 fgl2的高表達(dá)與 PARs表達(dá)水平的關(guān)系;
　　5)以流式細(xì)胞技術(shù)和共聚焦檢測 HCCLM6細(xì)胞高表達(dá) hfgl2蛋白后其細(xì)胞表面PARs的表達(dá),在蛋白水平鑒定 fgl2的高表達(dá)是否引起 PARs表達(dá)水

9、平的變化;
　　6)應(yīng)用流式細(xì)胞儀液態(tài)芯片-微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量(Cytometric Bead Array,CBA)技術(shù)檢測 HCCLM6細(xì)胞在高表達(dá) fgl2后細(xì)胞下游信號傳導(dǎo)途徑的活化;
　　7)利用PARs受體阻斷后觀察 fgl2高表達(dá)的HCCLM6細(xì)胞下游信號傳導(dǎo)途徑的活化;
　　2.sfgl2在 CHB患者中免疫調(diào)節(jié)機制研究
　　1)通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫共聚焦技術(shù)檢測慢性病毒性肝炎患者外周血 P

10、BMC中fgl2的表達(dá);
　　2)通過磁珠分選技術(shù)分離 PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-的Tregs,并與 PBMC混合培養(yǎng),檢測混合培養(yǎng)中CD8+T細(xì)胞的增殖;
　　3)酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測混合培養(yǎng)中細(xì)胞因子 IFN-γ的分泌水平;
　　實驗結(jié)果:
　　1.(1)在人肝癌組織中fgl2高表達(dá),并且與纖維蛋白沉積明顯相關(guān);(2)fgl2干擾腫瘤細(xì)胞系 HCCLM6細(xì)胞以及fgl2高表達(dá) H

11、CCLM6,在 mRNA水平和蛋白水平成功建立;(3)PAR1和PAR3在內(nèi)源性 fgl2刺激下基因水平和蛋白水平表達(dá)均明顯上調(diào),PAR2表達(dá)無明顯區(qū)別,PAR4檢測不到;(4)內(nèi)源性 fgl2表達(dá)刺激高侵襲性肝癌細(xì)胞系 HCCLM6激活 MAPK(ERK,JNK,p38)途徑;(5) PAR1和PAR3阻斷后,可降低 ERK,p38的磷酸化,但并不降低 JNK的磷酸化,而恰好相反 PAR2的阻斷可下調(diào) JNK磷酸化。
　　2.(

12、1)慢性乙型肝炎患者外周血 PBMC中高表達(dá) fgl2,包括分泌型和跨膜型;(2) Tregs可抑制CD8+T細(xì)胞增殖和分泌炎性因子功能;(3)阻斷 fgl2后,CD8+T細(xì)胞增殖能力和分泌炎性因子 IFN-γ功能增強。
　　結(jié)論:
　　1.人肝癌組織中高表達(dá)mfgl2,mfgl2的表達(dá)與纖維蛋白沉積具有明顯相關(guān)性。mfgl2通過凝血依賴和非依賴途徑激活PARs后活化MAPK途徑促進(jìn)肝癌的生長,侵襲和血管新生。
　　2

13、.CHB患者外周血中Tregs通過分泌sfgl2發(fā)揮對CD8+T細(xì)胞的抑制功能,并提示sfgl2有可能成為評估CHB患者免疫狀態(tài)的潛在預(yù)測因子。
　　第一部分 mfgl2凝血酶原酶在人肝癌細(xì)胞系中的作用
　　目的:探討人蛋白激活受體(Protein kinase receptors(PARs))在高侵襲性人肝癌細(xì)胞的表達(dá)及fgl2促進(jìn)腫瘤生長和血管生成中的作用機制研究。
　　方法:通過免疫組織化學(xué)染色,檢測人肝癌組織切

14、片中fgl2的表達(dá)情況,及與纖維蛋白沉積間的關(guān)系;用RNA干擾技術(shù)和瞬時電轉(zhuǎn)技術(shù)建立 fgl2敲除的和高表達(dá)的人高侵襲性肝癌細(xì)胞系 HCCLM6的細(xì)胞模型;RT- PCR方法檢測人高侵襲性肝癌細(xì)胞(HCCLM6)人纖維介素(hfgl2),蛋白激活受體(PAR1,PAR2,PAR3,PAR4)mRNA水平的表達(dá)情況,確定 fgl2的敲出和高表達(dá)建立成功,鑒定 HCCLM6高表達(dá) fgl2后 PARs在基因水平的變化;流式細(xì)胞技術(shù)和共聚焦檢

15、測 HCCLM6高表達(dá) hfgl2后其細(xì)胞表面 PARs在蛋白水平表達(dá)情況,鑒定 HCCLM6高表達(dá) hfgl2后 PARs在蛋白水平的變化;應(yīng)用流式細(xì)胞儀液態(tài)芯片(CBA)技術(shù)檢測 HCCLM6細(xì)胞高表達(dá) fgl2后細(xì)胞下游信號傳導(dǎo)途徑的活化情況;利用PARs受體阻斷后觀察 fgl2高表達(dá)的HCCLM6細(xì)胞下游信號傳導(dǎo)途徑的活化變化。
　　結(jié)果:在人肝癌組織中fgl2高表達(dá),并伴隨纖維蛋白沉積;fgl2干預(yù)的HCCLM6細(xì)胞以及

16、fgl2高表達(dá) HCCLM6,在 mRNA水平和蛋白水平成功建立;在內(nèi)源性 fgl2刺激下 HCCLM6的PAR1和PAR3在基因水平和蛋白水平表達(dá)均明顯上調(diào),PAR2表達(dá)無明顯區(qū)別,PAR4檢測不到;高侵襲性肝癌細(xì)胞系 HCCLM6在內(nèi)源性 fgl2刺激下激活 MAPK(ERK,JNK,p38)途徑;PAR1和PAR3阻斷后,可降低 ERK, p38的磷酸化,但并不降低 JNK的磷酸化;而恰好相反阻斷 PAR2后可下調(diào) JNK磷酸化。

17、
　　結(jié)論:人肝癌組織中高表達(dá)fgl2,fgl2的表達(dá)與纖維蛋白沉積明顯相關(guān),高表達(dá)fgl2的肝癌細(xì)胞可誘導(dǎo)PARs(PAR1,PAR3)高表達(dá),fgl2的表達(dá)可通過活化MAPK途徑直接或間接促進(jìn)肝癌腫瘤生長、侵襲和血管新生,阻斷PARs后可抑制MAPK途徑的活化,說明fgl2通過凝血依賴和非依賴途徑激活PARs后活化MAPK途徑促進(jìn)腫瘤的生長,侵襲和血管新生。
　　第二部分 sfgl2蛋白在慢性乙型肝炎中的免疫抑制功能研究

18、
　　目的:前期研究表明慢性乙型肝炎(CHB)外周血單核細(xì)胞(PBMC)中調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(CD4+CD25+CD127dim/-,Tregs)具有很強的免疫抑制功能,但具體機制目前仍不明了。
　　方法:流式細(xì)胞術(shù)檢測可纖維介素蛋白(fgl2)在 CHB患者外周血中表達(dá)水平,并通過 RT-PCR,共聚焦和western-blotting檢測 Tregs中sfgl2的表達(dá)。利用磁珠分選技術(shù)分離出20例 CHB患者的Tregs。按

19、1:3的比例與 PBMC進(jìn)行混合培養(yǎng)6天,同時分為 fgl2抗體阻斷組和CD3抗體刺激組以及空白對照組;并收集培養(yǎng)上清液和培養(yǎng)的細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)的細(xì)胞中CD8+ T細(xì)胞的增殖指數(shù);ELISA技術(shù)檢測上清液中IFN-γ的分泌水平。
　　結(jié)果:發(fā)現(xiàn)18例患者的CD8+ T細(xì)胞的增殖指數(shù)在阻斷 fgl2后明顯高于空白組(3.58±0.18比3.28±0.17,p=0.034),16例低于 CD3抗體刺激組(3.82±0.19

20、,p=0.026)。同時也檢測到IFN-γ在fgl2阻斷后明顯高于空白組(679.09±27.14比414.90±60.06, p=0.016),增高水平與抗 CD3刺激組(789.72±58.08)無明顯區(qū)別。
　　結(jié)論:這些數(shù)據(jù)表明在 CHB中Tregs分泌 sfgl2抑制CD8+ T細(xì)胞的增殖及分泌炎性因子 IFN-γ,提示 sfgl2可能成為預(yù)測 CHB患者免疫狀態(tài)的潛在因子。
　　第三部分 B1-a細(xì)胞對MHV-3

21、所致敏感小鼠肝炎的保護(hù)作用研究
　　目的:檢測小鼠肝臟感染鼠肝炎病毒3型(MHV-3)后B1-a淋巴細(xì)胞亞群變化,探討B(tài)1-a細(xì)胞在病毒性肝炎中的作用。
　　方法通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MHV-3誘導(dǎo)的耐受型(A/J)小鼠及暴發(fā)性肝炎(Balb/cj)小鼠肝臟及腹腔沖洗液中B細(xì)胞,B-1a細(xì)胞的基礎(chǔ)水平,以及在感染后不同時間點B細(xì)胞及其亞群的比例的變化。磁珠分選出小鼠肝臟B1-a細(xì)胞并過繼給Balb/cj小鼠,感染MHV-3病毒后

22、72h取小鼠肝臟組織進(jìn)行HE染色。
　　結(jié)果:未感染時MHV-3耐受型小鼠肝臟中B細(xì)胞明顯高于敏感型小鼠(43.6％±2.1％vs15.6％±3.3％,p<0.01),而B1-a細(xì)胞在耐受型小鼠中略高于敏感型小鼠(6.38％±2.13％ vs5.84％±1.32％,p>0.05);感染后耐受型小鼠B-1a明顯升高至(10.80％±2.82％,p<0.05),而敏感型小鼠呈現(xiàn)下降趨勢。Balb/cj小鼠在感染MHV-3后腹腔B1-a