NK細(xì)胞及其新型分子KCTD9在重型病毒性肝炎中的作用及免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 我國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，1-59歲人群攜帶率約7.18％，由HBV感染導(dǎo)致的重型肝炎或肝功能衰竭仍然是我國(guó)臨床常見(jiàn)急危重疾病。我國(guó)學(xué)者將肝功能衰竭的臨床分型定為：急性肝衰竭(Acute Liver Failure or Fulminant Hepatits, FHF)、亞急性肝衰竭 (Subacute Liver Failure, SALF)、慢加急性肝衰竭（Acute-on-Chronic Liver

2、 Failure, ACLF）和慢性肝衰竭（Chronic Liver Failure，CLF），其病情兇險(xiǎn)，特別是急性肝衰竭死亡率高達(dá)70％～90％，臨床上缺乏特異、有效的治療手段和干預(yù)靶點(diǎn)，除非緊急實(shí)施肝移植（國(guó)外以肝移植為主要治療手段，肝移植后5年存活率約為50％～60％），大部分患者預(yù)后不良，并發(fā)癥多。
　　 病毒性重型肝炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，一般認(rèn)為是病毒和宿主的相互作用的結(jié)果，現(xiàn)今較為公認(rèn)的是“兩次損傷學(xué)說(shuō)”，即由病

3、毒直接或間接（免疫反應(yīng)）所致的原發(fā)性損傷和內(nèi)毒素－細(xì)胞因子軸－肝損傷學(xué)說(shuō)為核心的繼發(fā)性損傷，加之患者肝臟儲(chǔ)備功能較差更易導(dǎo)致乙型肝炎重癥化。在國(guó)外，重型肝炎多由藥物性因素引起，而在我國(guó)則多由HBV感染所致。由于HBV病毒是一種非溶細(xì)胞性嗜肝病毒，感染后造成肝損傷的主要機(jī)制是機(jī)體的免疫系統(tǒng)主動(dòng)清除被感染的肝細(xì)胞，因而對(duì)HBV感染后機(jī)體免疫功能的研究對(duì)于闡述乙型肝炎的發(fā)病和進(jìn)展等方面的機(jī)制具有針對(duì)性的作用。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工

4、作中，我們利用人全基因組芯片技術(shù)（8600個(gè)探針），分析了重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）的基因差異表達(dá)譜，篩選出了在重型肝炎中高表達(dá)的263種基因，涉及多個(gè)類(lèi)別。KCTD9（Potassium Channel Tetramerisation Domain Containning 9）和KCNJ15（Potassium Inwardly-rectifying Channel, Subfamily J,

5、Member 15）是其中的兩種與離子通道相關(guān)的基因，在重型肝炎中這兩種基因表達(dá)分別上調(diào)6倍和7倍，通過(guò)后續(xù)的擴(kuò)大樣本的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該結(jié)果的可靠性。進(jìn)一步從基因和蛋白水平，我們檢測(cè)了265例臨床不同類(lèi)型HBV感染患者包括輕中度和重型乙型肝炎患者、以及健康對(duì)照人群的肝組織和PBMC中KCTD9分子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其僅在重型乙型肝炎患者有顯著高表達(dá)，提示其與病毒性乙型肝炎疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。為深入探討KCTD9分子在重型乙型肝炎發(fā)生發(fā)展

6、中的作用及可能的機(jī)制，我們利用本實(shí)驗(yàn)室建立的MHV-3誘導(dǎo)的Balb/Cj小鼠暴發(fā)型肝炎模型開(kāi)展了研究，發(fā)現(xiàn)KCTD9分子在MHV-3病毒感染后的小鼠肝組織和肝臟淋巴細(xì)胞尤其是NK細(xì)胞中高度表達(dá)，與前期人類(lèi)重型乙型肝炎的研究結(jié)果相似，提示可利用該模型深入剖析KCTD9參與HBV病毒誘導(dǎo)的重型肝炎肝細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。
　　 我們的前期工作首次表明，在病毒誘導(dǎo)的急性肝衰竭中肝臟NK細(xì)胞通過(guò)Fas/FasL和NKG2D/NKG2

7、DL途徑增強(qiáng)對(duì)肝細(xì)胞的殺傷，本研究的主要目標(biāo)是進(jìn)一步闡明肝臟NK細(xì)胞在急性肝衰竭中的作用及作用機(jī)制，研究NK細(xì)胞高表達(dá)KCTD9分子在肝細(xì)胞損傷和重型肝炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用及作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 一、NK細(xì)胞在重型病毒性肝炎中的作用及其免疫學(xué)機(jī)制研究1、在HBV-ACLF患者肝組織中檢測(cè)NK細(xì)胞的分布，同時(shí)在外周血NK細(xì)胞中檢測(cè)FasL、NKP30和NKP46的表達(dá)，探討NK細(xì)胞參與重型乙型肝炎急性肝損傷的機(jī)制；<

8、br>　　 2、在MHV-3誘導(dǎo)的Balb/Cj小鼠暴發(fā)型肝炎模型中，體內(nèi)耗竭NK細(xì)胞，觀察干預(yù)效果，探討NK細(xì)胞參與急性肝損傷的作用。
　　 二、 NK細(xì)胞新型分子KCTD9在重型乙型肝炎中的作用及其免疫學(xué)機(jī)制研究1、以重型乙型肝炎患者為對(duì)象的研究（1）收集重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血PBMC，對(duì)表達(dá)KCTD9的淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行定位。
　　 （2）分析表達(dá)KCTD9分子的外周血NK細(xì)胞與重型乙型肝炎

9、肝損傷嚴(yán)重程度的相關(guān)性。
　　 2、利用人NK92細(xì)胞系進(jìn)行KCTD9分子的體外功能研究。
　　 3、以MHV-3誘導(dǎo)的Balb/Cj小鼠暴發(fā)型肝炎模型為對(duì)象的研究。
　　 （1）構(gòu)建針對(duì)小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒，非相關(guān)干擾質(zhì)粒以及小鼠KCTD9的全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒，觀察在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中干擾或過(guò)表達(dá)KCTD9對(duì)于疾病病程的影響。
　　 （2）在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中觀察干擾或過(guò)表達(dá)KCTD9對(duì)于淋

10、巴細(xì)胞功能的影響，研究KCTD9參與暴發(fā)型肝炎NK細(xì)胞介導(dǎo)的急性肝損傷的作用機(jī)制。
　　 研究方法
　　 1、利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)HBV-ACLF患者和輕中度CHB患者肝組織中NK細(xì)胞的表達(dá)頻數(shù)；利用流式細(xì)胞術(shù)分析HBV-ACLF患者和輕中度CHB患者外周NK細(xì)胞FasL、NKP30和NKP46的表達(dá)情況。利用尾靜脈注射抗ASGM-1抗體耗竭NK細(xì)胞，觀察MHV-3誘導(dǎo)的Balb/Cj小鼠暴發(fā)型肝炎模型的生存率；<

11、br>　　 2、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KCTD9分子在重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者PBMC中NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平，并收集病例資料，統(tǒng)計(jì)分析表達(dá)KCTD9的NK細(xì)胞比例與肝損傷嚴(yán)重程度的相關(guān)性。同時(shí)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)重型乙型肝炎患者肝組織連續(xù)切片中NK細(xì)胞表達(dá)KCTD9的情況。
　　 3、利用NK92細(xì)胞系，將人KCTD9表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染入該細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染24小時(shí)后NK92細(xì)胞

12、KCTD9蛋白和活化分子CD69的表達(dá)；將轉(zhuǎn)染后的NK92細(xì)胞與HepG2.2.15細(xì)胞按照梯度效靶比共培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定ALT釋放量，計(jì)算NK92細(xì)胞的殺傷效率；ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NK92細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的情況；利用流式細(xì)胞術(shù)篩選轉(zhuǎn)染后NK92細(xì)胞的活化性/抑制性受體表達(dá)譜。
　　 4、構(gòu)建針對(duì)小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒和全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒，利用尾靜脈高壓注射技術(shù)，將KCTD9干擾質(zhì)粒或表達(dá)質(zhì)粒注射入MHV-3

13、誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝炎模型小鼠體內(nèi)，從小鼠的生存情況、血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝臟組織學(xué)改變等方面研究KCTD9分子在暴發(fā)型肝炎疾病病程中的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)shRNA干擾對(duì)于本模型小鼠肝臟NK細(xì)胞活化和KCTD9表達(dá)的影響，利用磁珠分選技術(shù)將肝臟NK細(xì)胞分離純化，體外檢測(cè)其針對(duì)MHV-3感染的肝細(xì)胞的殺傷活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)shRNA干擾后肝臟NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（IFN-γ和TNF-α）水平。
　　 結(jié)論
　　 1、本研究在人

14、類(lèi)HBV-ACLF疾病及小鼠暴發(fā)型肝炎模型中證實(shí)了NK細(xì)胞在肝臟組織中大量存在，活化的肝臟NK細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)表達(dá)的FasL發(fā)揮殺傷功能，進(jìn)而在病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮重要作用。
　　 2、體外研究闡明了KCTD9分子通過(guò)降低NKG2A受體的表達(dá)促進(jìn)NK細(xì)胞活化，從而誘導(dǎo)之后的殺傷及細(xì)胞因子分泌功能。
　　 3、本研究闡明了KCTD9通過(guò)活化NK細(xì)胞從而參與病毒誘導(dǎo)的急性肝細(xì)胞損傷及重型肝炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。