五種中藥注射液對大鼠體外肝微粒體中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的影響.pdf

1、目的:一、建立高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)，測定大鼠體外肝微粒體中對乙酰氨基酚、1-羥基咪達唑侖和4-羥基雙氯芬酸的濃度。二、建立大鼠體外肝微粒體孵育體系。選擇非那西丁、咪達唑侖和雙氯芬酸分別作為CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的特異性探針藥物，用高效液相色譜法分別測定大鼠肝微粒體孵育后相應的代謝物（對乙酰氨基酚、1-羥基咪達唑侖和4-羥基雙氯芬酸）的濃

2、度，得出三種探針藥物的酶動力學參數(shù)，評價CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9三種酶的活性。三、考察五種中藥注射液對大鼠體外肝微粒體中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的影響。向孵育系統(tǒng)中分別加入不同濃度的丹參川芎嗪注射液、谷紅注射液、銀杏葉提取物注射液、參麥注射液以及參附注射液，測定探針藥物代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚、1-羥基咪達唑侖和4-羥基雙氯芬酸的濃度，計算半數(shù)抑制濃度IC50，考察五種中藥注射液對體外肝微粒體中CYP1A2

3、、CYP3A4和CYP2C9酶活性的影響。
　　方法:建立和優(yōu)化高效液相色譜條件:1、測定大鼠肝微粒體中對乙酰氨基酚的濃度:柱溫選擇30℃，流速設定0.8mL·min-1，Hypersil BDS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，檢測波長245nm，流動相A為乙腈，B為50.0mmol·L-1 Na2HPO4緩沖液(pH4.5)，梯度洗脫;2、測定大鼠肝微粒體中1-羥基咪達唑侖的濃度:柱溫選擇30℃，流速設定1.0mL

4、·min-1，Hypersil BDS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，檢測波長230nm;流動相A為乙腈，B為10.0mmol·L-1Na2HPO4緩沖液(pH8.4)，梯度洗脫;3、測定大鼠肝微粒體中4-羥基雙氯芬酸的濃度:柱溫選擇30℃，流速設定0.8mL·minl，Hypersil BDS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測波長276nm，流動相A為乙腈，B為50.0mmol·L-1 Na2HPO4緩沖

5、液(pH4.5)，等度洗脫。優(yōu)化大鼠肝微粒體孵育體系的蛋白濃度，優(yōu)化孵育時間。以Lineweaver-Burk為坐標求得Km與Vmax值。將不同濃度的丹參川芎嗪注射液、谷紅注射液、銀杏葉提取物注射液、參麥注射液以及參附注射液分別加入到孵育體系中，測定探針藥物代謝產(chǎn)物的濃度，評價對三種酶活性的影響，并分別計算出五種中藥注射液對CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　結(jié)果:在建立的色譜條件下，探針藥物

6、和代謝產(chǎn)物峰形良好，各自內(nèi)標亦符合標準，整個體系中干擾因素較小。對乙酰氨基酚的酶動力學參數(shù):Km=102.0μmol·L-1，Vmax=1.05nmol·min-1·mg protein-1;對乙酰氨基酚線性區(qū)間0.10～49.90μmol/L。處理回收率＞85％，日內(nèi)、日間精密度均＜10％，穩(wěn)定性均＜10％，準確度在85％～115％區(qū)間內(nèi)。1-羥基咪達唑侖的酶動力學參數(shù): Km=57.0μmol·L-1，Vmax=1.05nmol·m

7、in-1·mg protein-1;1-羥基咪達唑侖線性區(qū)間0.10～29.90μmol/L，處理回收率＞85％，日內(nèi)、日間精密度均＜10％，穩(wěn)定性均＜10％，準確度在85％～115％區(qū)間內(nèi)。4-羥基雙氯芬酸的酶動力學參數(shù)Km=16.9μmol·L-1，Vmax=1.26nmol·min-1·mgprotein-1;4-羥基雙氯芬酸線性區(qū)間0.20～29.90μmol/L，處理回收率＞85％，日內(nèi)、日間精密度均＜10％，穩(wěn)定性均＜10％

8、，準確度在85％～115％區(qū)間內(nèi)。丹參川芎嗪注射液對CYP1 A2、CYP3A4和CYP2C9無抑制;谷紅注射液對CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9無抑制;銀杏葉提取物注射液對CYP3A4和CYP2C9的IC50分別為11.48％、12.91％;參麥注射液對CYP1A2、CYP3A4無抑制，對CYP2C9的IC50為3.68％;參附注射液對CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9的IC50分別為4.27％、6.65％、5.23％。

9、
　　結(jié)論:本實驗采用體外肝微粒體孵育法，通過探針藥物，評價大鼠肝微粒體中CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶的活性，方法具有操作性、可靠性。通過建立大鼠肝微粒體孵育體系，考察五種中藥注射液對CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9酶活性產(chǎn)生的影響。經(jīng)數(shù)據(jù)整理后發(fā)現(xiàn):丹參川芎嗪注射液在體外對CYP1 A2、CYP3A4和CYP2C9無明顯抑制作用;谷紅注射液在體外對CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9無明顯抑制作用;銀杏