乙型肝炎病毒X蛋白相關(guān)原發(fā)性肝癌發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于所有癌癥的第五位，且其死亡率為所有癌癥死亡率的第三位，嚴(yán)重威脅著人類健康。而肝癌發(fā)生的一個(gè)最主要的危險(xiǎn)因素就是肝炎病毒感染，流行病學(xué)資料顯示50-55％的原發(fā)性肝癌發(fā)生是由于持續(xù)性的乙型肝炎病毒(HBV)感染引起。由HBV導(dǎo)致的慢性感染者全世界約有4億人，其中50％的男性攜帶者和14％的女性攜帶者最終會(huì)死于慢性感染導(dǎo)致的肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)等并發(fā)癥。目前人們對(duì)肝癌的發(fā)

2、病機(jī)制并不十分清楚。過去人們普遍認(rèn)為遺傳學(xué)上的基因突變是腫瘤發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵事件，尤其是抑癌基因的體細(xì)胞突變與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。但是，近年來隨著對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)的深入，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也起到非常重要的作用。由遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變引起的原癌基因的活化和抑癌基因的滅活共同引起細(xì)胞惡性改變，表觀遺傳學(xué)修飾的改變甚至早于遺傳學(xué)改變?cè)诎┣捌诩撮_始出現(xiàn)。HBX作為HBV基因組中最小的開放閱讀框，同時(shí)也是結(jié)構(gòu)和功能上

3、重疊最明顯的區(qū)域，編碼產(chǎn)生的HBx蛋白被認(rèn)為與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。它可以作為原癌基因或者共同作用因子促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，最近的研究顯示HBx還參與了肝癌發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。
　　 HBx可以通過上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的活性導(dǎo)致基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生。但是HBx激活DNMTs的機(jī)制仍然不清楚。Micro RNAs(miRNAs)是一類長度約19-25個(gè)堿基的單鏈非編碼小分子RNA，它可以通過靶基因m

4、RNA的3'-UTR區(qū)完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合后導(dǎo)致靶基因降解或抑制其翻譯，來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在生物體內(nèi)發(fā)揮著許多重要作用，包括參與生物體的發(fā)育，分化，增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)等，研究顯示miRNAs表達(dá)譜的改變?cè)诎[瘤的許多人類疾病的發(fā)生中都起著重要的作用。一些miRNAs可能作為原癌基因或者抑癌基因發(fā)揮作用。而越來越多的證據(jù)顯示miRNAs與DNA甲基化有著互相調(diào)節(jié)關(guān)系，可以互為靶向。
　　 在本課題中，我們研究了在HBV相關(guān)性

5、肝癌中是否存在著異常表達(dá)的能調(diào)控機(jī)體DNA甲基化狀態(tài)的miRNAs，參與了腫瘤的發(fā)生過程。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中基于HBx轉(zhuǎn)基因小鼠及對(duì)照野生型C57/BL6小鼠肝臟組織miRNA芯片發(fā)現(xiàn)miR-152在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟組織中表達(dá)量發(fā)生明顯下調(diào)。而通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，DNMT1可能是miR-152的靶基因。隨后我們通過體外雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證明miR-152可以通過直接與DNMT1的3’-UTR區(qū)發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合，從而靶向抑制其

6、mRNA和蛋白表達(dá)水平，并調(diào)控機(jī)體的DNA甲基化狀態(tài)。病人組織檢測結(jié)果也顯示miR-152的表達(dá)量在HBV相關(guān)性肝癌組織中比對(duì)應(yīng)的癌旁組織發(fā)生了頻繁的顯著下調(diào)，且miR-152的表達(dá)量與DNMT1的mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)證明在HepG2.2.15細(xì)胞中過表達(dá)miR-152可以導(dǎo)致基因組整體DNA甲基化水平(GDM)的下降；而相反的，在HepG2細(xì)胞中，miR-152的抑制劑可以導(dǎo)致細(xì)胞的GDM上升，以及腫瘤抑制基因GSTP1和

7、CDH1的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著上升而抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)證明了miR-152參與了HBV相關(guān)性肝癌發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生中起到抑癌基因的作用，豐富了HBV-HCC的發(fā)病機(jī)制。并首次在消化系統(tǒng)疾病中報(bào)道m(xù)iRNA可以調(diào)控DNA甲基化，為豐富不同表觀遺傳學(xué)修飾之間的相互調(diào)控機(jī)制，以及理解表觀遺傳學(xué)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)起到了積極的作用。我們同樣相信我們的發(fā)現(xiàn)對(duì)潛在的相關(guān)治療可以產(chǎn)生積極的影響意義。本

8、研究的結(jié)果為發(fā)展使用外源合成的miR-152作為表觀遺傳學(xué)藥物治療HBV相關(guān)性肝癌提供了有力的理論支持。miR-152可以單獨(dú)使用或者與其他藥物聯(lián)合使用，它可以通過重新激活腫瘤抑制基因以及糾正腫瘤細(xì)胞的異常DNA甲基化模式，來達(dá)到治療腫瘤的目的，為HBV-HCC提供了新的miRNA藥物治療靶點(diǎn)。
　　 除了小RNA分子，近年來，另一類長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)也逐漸進(jìn)入人們的視角。l

9、ncRNAs是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，它們本身并不編碼蛋白或者只是編碼很短的多肽。近年來，越來越多的研究表明lncRNAs在表觀遺傳學(xué)調(diào)控領(lǐng)域也有著非常重要的作用，它可以通過各種不同的機(jī)制調(diào)控基因的表達(dá)水平，參與基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白功能調(diào)節(jié)等多種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程。lncRNAs參與調(diào)控了多種生理病理學(xué)過程，參與了各種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。那么HBV是否可以通過影響lncRNA

10、s的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生呢?
　　 在本研究中，我們還從HBx轉(zhuǎn)基因鼠角度入手，消除其他干擾因素，研究了HBV對(duì)lncRNAs的表達(dá)影響，以及l(fā)ncRNAs在HBV-HCC發(fā)生中的作用及其分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中我們使用lncRNAs芯片技術(shù)篩選到一批在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中比野生型小鼠發(fā)生顯著差異的lncRNAs，并且用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)擴(kuò)大樣本量對(duì)它們?cè)诓煌挲g和性別的轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠肝臟組織中的表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證。證實(shí)了HB

11、x確實(shí)可以影響機(jī)體的lncRNAs表達(dá)，說明HBV感染者可能有著其特異的lncRNAs表達(dá)譜，而且其中很多l(xiāng)ncRNAs表達(dá)變異在感染的早期未發(fā)生腫瘤時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)，提示它們的表達(dá)差異可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)HBx誘導(dǎo)下調(diào)的lncRNA-AK050349，可以與vimentin蛋白發(fā)生相互結(jié)合并影響其結(jié)構(gòu)，從而改變正常的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)外促進(jìn)腫瘤的增殖和遷移。
　　 我們的研究證明了HBx相關(guān)的lncRNAs在原發(fā)