槲皮素抑制膠質疤痕愈合的分子生物學機制的探究.pdf

1、背景和目的：
　　 槲皮素是一種廣泛存在于自然界（如蔬菜、水果及其他日常飲食）中的具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤和神經保護作用的黃酮類化合物。大量研究表明槲皮素可通過改變反應性星形膠質細胞基因的表達來保護神經元和減少神經變性疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，探究槲皮素對劃痕愈合的影響及其作用機制，將為我們后續(xù)研究槲皮素和反應性星形膠質細胞在腦損傷中的作用奠定基礎，也為膠質疤痕的形成機理提供新的研究思路。
　　 膠質成熟因子，是由142個

2、氨基酸殘基組成的分子量為17 kDa的蛋白質小分子，主要包括膠質成熟因子-β(GMFB)和膠質成熟因子-γ(GMFG)。GMFB主要表達分布于脊椎動物的大腦中，在神經元和膠質細胞的生長和分化中起了重要的調節(jié)作用。GMFG，膠質成熟因子家族的一個新成員，其基因序列和氨基酸序列和GMFB具有高度的相似性（在大鼠中，其基因水平的相似度達71％;氨基酸序列的相似度達78.9％），故將其命名為膠質成熟因子-γ。GMFG的表達分布與GMFB的表達分

3、布不同，GMFG高度表達分布在造血系統(tǒng)（包括粒細胞性白血病和淋巴細胞性白血病）、胸腺、脾臟、胚胎的肝臟及肺臟中，GMFG的進化與有分化和增殖潛能的造血免疫系統(tǒng)的進化同步。GMFG在神經和大腦中的表達分布并不比其他組織中高，大鼠大腦中GMFG的mRNA可在大腦海馬CA3區(qū)的錐體細胞中檢測到[5]。GMFG在大鼠（鼠齡為E14-P1）的視網膜的內限膜中也可被探測到，對其膠質細胞的生長和分化可能起了重要作用。但是到目前為止，GMFG在大腦中詳

4、細的表達分布狀況及其功能仍然未知。
　　 近年來更多的研究聚焦于槲皮素的抗腫瘤作用，研究表明槲皮素可誘導多種腫瘤細胞的凋亡如白血病細胞、胰腺癌細胞等?？谇击[狀上皮癌，是世界上第六種最常見的惡性腫瘤;外科手術和放療/化療是治療口腔鱗狀上皮癌的最佳選擇方案，但口腔上皮癌細胞的多重耐藥性是其化療根治和化療失敗的一大難題。P-glycoprotein(P-gp)是介導腫瘤細胞多重耐藥的主要機制之一，大量研究顯示槲皮素能抑制P-gp的表達

5、，降低多種腫瘤細胞的耐藥性，如人胰腺癌細胞和Caco-2細胞;而是否槲皮素可以抑制口腔鱗狀上皮癌的生長，并通過降低P-gp的表達來逆轉其多重耐藥性目前尚不清楚。
　　 本研究分為以下三個部分:
　　 第一部分、槲皮素抑制膠質疤痕愈合的分子生物學機制的探究
　　 一、實驗目的：建立體外星形膠質細胞的遷移模型，探究槲皮素對劃痕愈合及其對膠質疤痕中星形膠質細胞增殖和遷移的影響，并探究其可能的分子生物學機制，為膠質疤痕的

6、治療尋找一種潛在的藥物。
　　 二、實驗方法：
　　 1.星形膠質細胞GFAP染色鑒定原代星形膠質細胞經GFAP免疫熒光染色后進行純度鑒定，陽性細胞達95％以上，符合實驗要求。
　　 2.體外星形膠質細胞遷移模型的建立及應用實驗分為三組，第一組為對照組(C組)，僅作劃痕處理;第二組為劃痕加DMSO處理組（D組），第三組為劃痕加槲皮素處理組（Q組）;劃痕操作如下，于35mm培養(yǎng)皿的蓋上劃出縱橫交錯的九道格，將蓋置于

7、膠質細胞培養(yǎng)皿下面，用10μL加樣器槍頭沿蓋上的格橫豎各劃九道，換液除去脫落細胞，然后置于5％的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組三個培養(yǎng)皿。在低倍鏡下拍照，并通過NIS Elements D軟件測量劃痕的寬度，以此作為該視野劃痕的寬度計算其遷移指數(shù)。遷移指數(shù)的計算公式為:Ix=3Lx/(LC+LD+LQ)。
　　 3.Western blot通過Western blot分析槲皮素對caspase-3、ERK1/2及p-ERK1/2蛋

8、白表達的影響;然后通過Gel-Pro analyzer(Alpha Innotech Corp，CA)分析軟件，對蛋白的表達狀況進行定量分析（目的蛋白/內參蛋白）。
　　 4.Live/Dead染色培養(yǎng)成熟的星形膠質細胞用PBS洗三遍以后，取200μL Live/Dead混合標記液加入到各組培養(yǎng)皿中進行避光染色15min后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察活細胞（呈綠色）和損傷細胞（呈紅色）的情況。
　　 5.Click-iT

9、EdU Test培養(yǎng)成熟的星形膠質細胞半量換液，加入1mL含20μmol/LEdU的全培養(yǎng)液。將其置于37℃，5％的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，加入1mL3.7％甲醛室溫下固定15min，用3％ BSA洗兩遍。然后再加入1mL0.5％Triton X-100室溫下孵育20min;用3％ BSA洗兩遍。然后加入0.5mL Click-iT反應混合液，室溫下避光振蕩30min。用3％ BSA洗一遍;然后再加入1mL1×Hoech

10、st33342反應液室溫下避光反應30min。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計算其增殖細胞百分比，以上實驗隨機重復3次。
　　 6.細胞周期分析將處理后的星形膠質細胞用0.25％胰酶37℃消化5min，收集的懸浮細胞室溫下1500 r/min離心5min。棄上清，加入250μL胰酶溶液（A液），混勻后，室溫下反應10min。然后再加入200μL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），混勻后，室溫下反應10mi

11、n。最后加入200μL冰冷的PI染液(C液)，混勻后，4℃避光反應10min;然后將其在3h內上流式細胞儀檢測。
　　 三、實驗結果：
　　 1.槲皮素對體外星形膠質細胞劃痕愈合的影響與對照組相比，槲皮素(50μmol/L)能明顯抑制劃痕的愈合，在6h時就有明顯的統(tǒng)計學差異，而DMSO對劃痕的愈合無影響;在第72h時C組和D組的部分視野已開始愈合。
　　 2.槲皮素對星形膠質細胞生存的影響LIVE/DEAD染色后

12、鏡下觀察C組、D組和Q組的細胞均為綠色活細胞，生長狀況良好。這說明該濃度槲皮素（50μmol/L）對星形膠質細胞沒有毒性作用，對其死亡無影響。
　　 3.槲皮素對星形膠質細胞凋亡的影響免疫熒光染色和Western blot檢測顯示槲皮素（50μmol/L）對凋亡蛋白酶的表達無影響，以上研究表明槲皮素（50μmol/L）對星形膠質細胞的凋亡無影響。
　　 4.槲皮素對星形膠質細胞增殖和細胞周期的影響與對照組相比，槲皮素能明

13、顯抑制星形膠質細胞的增殖，對照組星形膠質細胞的增殖比例是槲皮素處理組的10倍以上。槲皮素處理24h后，G1期星形膠質細胞的比例由82.04％增加到92.06％，而S期和G2期的比例相應降低。以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過抑制星形膠質細胞DNA的合成來抑制其增殖。
　　 5.槲皮素可通過降低ERK1/2的磷酸化水平來抑制星形膠質細胞的遷移與對照組相比，第24h時槲皮素(50μmol/L)能使ERK1/2的磷酸化水平降低大約45％，此外，

14、槲皮素對ERK1/2磷酸化水平的影響有一定的時間和濃度依賴性。隨時間的變化，ERK1/2的磷酸化水平逐漸降低，第12h時ERK1/2的磷酸化水平降到了最低，此后開始回升。在0-100μmol/L的濃度范圍內，隨著槲皮素的濃度增加，ERK1/2的磷酸化水平逐漸降低。
　　 U0126可明顯降低ERK1/2的磷酸化水平，并且可明顯抑制星形膠質細胞體外劃痕的愈合。用磷酸酶抑制劑，釩酸鹽，維持槲皮素處理過的星形膠質細胞的ERK1/2的磷

15、酸化水平，發(fā)現(xiàn)釩酸鹽可逆轉槲皮素抑制劃痕愈合的效應。
　　 四、實驗結論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的槲皮素（50μmol/L）對膠質劃痕中星形膠質細胞的生存和凋亡無影響，槲皮素可通過抑制膠質劃痕中星形膠質細胞的增殖和遷移來抑制劃痕的愈合。
　　 第二部分、膠質成熟因子在大鼠大腦中的表達狀況分析及其功能的初步探究
　　 一、實驗目的：分析GMFG蛋白在大鼠中樞神經系統(tǒng)中的表達狀況，比較GMFB和GMFG在大

16、腦組織和細胞中的表達和分布狀況，探究GMFG在星形膠質細胞中的功能。
　　 二、實驗方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 原代星形膠質細胞的培養(yǎng)、大鼠神經元的培養(yǎng)、大鼠膠質瘤9L和C6細胞系的培養(yǎng)。
　　 2.人膠質瘤及其正常大腦組織樣品所有人膠質瘤及其正常大腦組織樣品（共22例）均取自于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院神經外科。
　　 3.免疫熒光染色用細胞免疫熒光染色檢測GMFB和GMFG在原代星形膠質細胞及

17、神經元上的表達情況。
　　 4.Western blot通過Western blot檢測GMFB和GMFG在原代星形膠質細胞及大腦組織中表達狀況。
　　 5.免疫組化通過免疫組化染色探究GMFB和GMFG在中樞神經系統(tǒng)中的表達分布狀況。
　　 6.Real-time PCR通過熒光定量PCR檢測GMFB和GMFG在不同細胞系或不同組織中基因水平上的變化7.免疫共沉淀通過免疫共沉淀探究并分析星形膠質細胞中GFAP和

18、GMFB/GMFG相互作用。
　　 三、實驗結果：
　　 1.GMFB和GMFG在大鼠中樞神經系統(tǒng)中的表達狀況分析本研究從基因、蛋白及細胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經系統(tǒng)的表達及存在，免疫熒光染色顯示GMFB主要表達分布于星形膠質細胞的細胞核中，幾乎所有細胞均表達GMFB;而GMFG表達分布于星形膠質細胞的細胞核與細胞質中，GMFG在細胞質中的表達以細胞核為中心向細胞質的四周放射。
　　 2.GMFB

19、和GMFG在大鼠大腦中的區(qū)域依賴性分布免疫組化結果表明，GMFB在大腦中分布廣泛，尤其是在海馬的錐體細胞中表達最為明顯。相比之下，GMFG并不是在整個大腦中都可探測到，僅可在部分細胞中探測到，GMFG在海馬的錐體細胞中表達最強，其次是大腦髓質層和大腦的基底核，在大腦皮質的表達最弱。
　　 3.GMFB和GMFG在大鼠大腦中的年齡依賴性表達GMFB的mRNA表達水平明顯高于GMFG，GMFB的mRNA表達水平從出生后的第7天開始明

20、顯下降，出生后的第8個月達到最低;而GMFG的mRNA表達水平在出生后的第7天達到了最高峰，此后開始下降，出生后的第8個月達到最低。在出生后的第7天GMFB蛋白的表達量達到了高峰，隨后開始降低，1個月后趨于穩(wěn)定;而GMFG蛋白的表達量在出生后一直降低。
　　 4.GMFB在星形膠質細胞和膠質瘤細胞上的表狀況分析結果顯示GMFB在大鼠膠質瘤細胞細胞核上的表達增強，在細胞質中的表達無明顯變化。前面的研究已證實隨著中樞神經系統(tǒng)的成熟，

21、GMFB在星形膠質細胞上的表達逐漸減弱。膠質瘤細胞作為一種未成熟和未分化的膠質細胞在其細胞核上呈現(xiàn)出高表達。因此推測可能存在一個負反饋調節(jié)機制，在星形膠質細胞的成熟和GMFB的表達之間存在重要的調節(jié)作用。正因為這種負反饋調節(jié)機制導致了GMFB在膠質瘤細胞系9L和C6細胞核上的高表達。
　　 5.GMFG在星形膠質細胞和膠質瘤細胞上表狀況分析結果顯示膠質瘤細胞中GMFG無論是在mRNA水平上還是蛋白水平上的表達狀況均明顯低于其在星

22、形膠質細胞上的表達水平。除此之外，通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)GMFG在膠質瘤細胞上的表達強度明顯低于其在星形膠質細胞上的表達強度。研究顯示GMFG和GFAP之間確實存在某種相互作用，而GMFB和GFAP之間無該種相互作用。
　　 6.GMFG在人腦膠質瘤標本上的表達狀況分析免疫組化實驗結果顯示4/5(80％)的正常腦組織標本呈陽性，4/7(57.14％)Ⅳ級膠質瘤組織標本呈陽性。統(tǒng)計學結果顯示Ⅳ級膠質瘤組織標本的陽性率顯著低于正常腦組

23、織標本(x2=6.5，p＜0.05，費舍爾確切概率法);在陽性標本中，不管細胞類型如何，GMFG在細胞質和細胞核中均呈現(xiàn)陽性。Western blot結果顯示，與正常大腦組織標本相比，Ⅳ級膠質瘤組織標本的表達水平明顯下降。
　　 四、實驗結論：
　　 本研究從基因、蛋白及細胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經系統(tǒng)的存在，比較了GMFB和GMFG在大鼠大腦中的組織分布狀況，發(fā)現(xiàn)其在大鼠大腦中的分布具有區(qū)域依賴性，其表

24、達具有時間依賴性;此外，本研究發(fā)現(xiàn)GMFB和GMFG在正常的大鼠星形膠質細胞和膠質瘤細胞系之間表達狀況的差異，并進一步證實了其在人正常的腦組織和Ⅳ級膠質瘤標本上的表達狀況之間的差異。本研究第一次提出了GMFB在膠質細胞中表達狀況的負反饋調節(jié)機制，并對GMFG在膠質瘤細胞轉化中的作用做了初步探究。
　　 第三部分、槲皮素對KBV細胞及其耐藥機制的影響
　　 一、實驗目的：探究槲皮素對耐長春新堿的口腔鱗狀上皮癌KBV細胞系侵

25、襲、遷移、增殖及其凋亡的影響，進一步分析槲皮素降低耐藥相關蛋白P-gp表達后KBV細胞對長春新堿的敏感性。
　　 二、實驗方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)人KBV細胞細胞系采用含10％的胎牛血清、200nmol/L VCR的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
　　 2.Transwell體外遷移實驗將饑餓12-24h后的KBV細胞制備細胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1-2遍，用含0.1

26、％ FBS的1640配養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調至于5x104。取200μL細胞懸液加入Transwell上室，含10％FBS的1640培養(yǎng)基500μL加入下室。37℃5％的CO2培養(yǎng)12h后，用棉簽擦去上室內細胞，多聚甲醛固定10分鐘，0.1％結晶紫室溫孵育10min，清水漂洗3遍以上。Transwell小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)。
　　 3.Transwell體外侵襲實驗將用1640做1∶5稀釋后的Matr

27、igel涂于Insert細胞生長面，150-200μL/cm2，37℃作用30分鐘，備用。將饑餓12-24h后的KBV細胞制備細胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1-2遍，用含0.1％ FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調至于5x104個/cm2。取200μL細胞懸液加入Transwell上室，取含10％ FBS的1640培養(yǎng)基500μL加入下室。37℃，5％的CO2培養(yǎng)36h后，用棉簽擦去Matrigel和上室內細胞，多聚甲醛固定

28、10分鐘;0.1％結晶紫室溫染色10分鐘，清水漂洗3遍以上。Transwell小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察拍照計數(shù)。
　　 4.μTT測定細胞的生長取5×103個細胞接種于96孔板上，待細胞貼壁后將培養(yǎng)基移去，分別加入200μL含濃度為0、25、50、75和100μmol/L槲皮素的10％ FBSRPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h、24h和48h后，每孔中加入20μL5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二

29、苯基四氮唑溴鹽(MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后用200μL加樣槍將液體小心地移去，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，微振蕩器振蕩10min，用SpectraMaxM-5多功能酶標儀在490nm波長下測光密度值。每組設6個重復孔，重復三次試驗。
　　 5.Click-iT Edu檢測將處理好的KBV半量換液，加入1mL含20μmol/L EdU的全培養(yǎng)液，其最終工作濃度為10μmol/L。將其置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培

30、養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，加入1mL3.7％甲醛室溫下固定15min，棄去固定液，用3％ BSA洗兩遍。然后再加入1mL0.5％ Triton X-100室溫下孵育20min;棄去通透液，用3％ BSA洗兩遍。然后加入0.5mL Click-iT反應混合液，室溫下避光振蕩30min。棄去反應液，用3％ BSA洗一遍。然后再加入1mL1X Hoechst33342反應液室溫下避光反應30min。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并

31、計算其增殖細胞百分比，以上實驗隨機重復3次。
　　 6.細胞周期分析將收集的懸浮細胞室溫下400g離心5min。棄上清，加入250μL胰酶溶液（A液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應10min。然后再加入200μL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應10min。最后加入200μL冰冷的PI染液（C液）用手指輕彈將其混勻，4℃避光反應10min。然后將其在3h內上流式細胞儀檢測，以上實驗隨機重復

32、3次。
　　 7.細胞凋亡分析將消化的KBV細胞用PBS洗滌細胞兩次，收集1×106個細胞，加入500μL的Binding Buffer重懸細胞。加入5μL的Annexin V-FITC混勻后;再加入5μL的Propidium Iodide，混勻;室溫避光反應5-15min。在染色后1h內上流式細胞儀進行檢測，以上實驗隨機重復三次。
　　 8.Western blot Western blot分析槲皮素對caspase-

33、3、Bax、Bcl-2及P-gp蛋白表達的影響，然后通過Gel-Pro analyzer(Alpha Innotech Corp, CA)分析軟件，對蛋白的表達狀況進行定量分析（目的蛋白/內參蛋白）。
　　 三、實驗結果：
　　 1.MTT檢測槲皮素對KBV細胞生長能力的影響低濃度(25μmol/L)的槲皮素處理12h、24h和48h后，KBV細胞的生長抑制率分別為（13.76±2.679）％，（14.63±4.262）

34、％和（16.80±3.876）％,統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)該濃度槲皮素的生長抑制效應并未隨著時間增長而升高。槲皮素對KBV細胞的生長抑制效應隨著槲皮素濃度的上升而增高，第48h時，75μmol/L槲皮素的生長抑制率為50％，因此其IC50值為75μmol/L。
　　 2.槲皮素可抑制KBV細胞遷移和侵襲能力與對照組相比，處理組遷移侵襲比例顯著降低，25μmol/L，50μmol/L和100μmol/L槲皮素處理組其遷移細胞百分比分別為60

35、.14％，30.40％和13.93％(P＜0.01);侵襲細胞百分比分別為38.57％、22.27％和5.12％(P＜0.01)。
　　 3.槲皮素對KBV細胞增殖及其細胞周期的影響50μmol/L槲皮素處理24h后，對照組增殖細胞百分比為槲皮素處理組的兩倍。50μmol/L槲皮素處理24h后，G1期細胞的比例明顯升高，由42.41％升高到52.66％(P＜0.01)，S期細胞的比例明顯降低，由52.24％降低到43.04％(P

36、＜0.01)。
　　 4.槲皮素對KBV細胞凋亡的影響與對照組相比，槲皮素處理組其凋亡細胞百分比顯著升高，且有一定的濃度依賴性，槲皮素濃度為100μmol/L時其凋亡細胞百分比為17.53％。
　　 5.槲皮素對Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白表達的影響槲皮素處理24h后，隨著槲皮素濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和35kDa的caspase-3蛋白表達量逐漸降低，而抑凋亡相關蛋白Bax和17kDa的cleav

37、ed caspase-3蛋白表達量逐漸升高，均有一定的濃度依賴性，以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過線粒體途徑來誘導KBV細胞的凋亡。
　　 6.槲皮素對耐藥相關蛋白P-glycoprotein表達的影響用0、25、50、75及100μmol/L槲皮素處理KBV細胞24h后，Western blot檢測顯示P-gp的表達量發(fā)生明顯改變，隨著槲皮素濃度的升高，P-gp的表達量逐漸降低，有一定的濃度依賴性。與對照組相比，25、50、75及10

38、0μmol/L槲皮素處理KBV細胞24h后，P-gp的表達量分別為91％、83％、66％和45％。
　　 7.槲皮素可通過下調P-gp表達來增強KBV細胞對長春新堿的敏感性與對照組和長春新堿單獨處理組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低P-gp的表達量，而與槲皮素處理組相比卻無明顯統(tǒng)計學差異。與單獨用藥組和對照組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低其增殖細胞百分比，并且其凋亡比例也顯著升高。與對照組和單獨處理組相比，聯(lián)合用藥組KBV細胞的遷移和侵襲