單基因遺傳性骨病的臨床與分子病因?qū)W研究.pdf

1、第一部分 X連鎖顯性低磷性佝僂病PHEX基因突變篩查
　　目的:低磷性佝僂病(Hypophosphatemic rickets, HR)是一組因腎臟丟失磷酸鹽導(dǎo)致血磷降低,引起骨礦化異常的疾病。臨床上有四種類型,其中以 X連鎖顯性低磷性佝僂病(X-linked dominant hypophosphatemic rickets, XLH)最為常見。該病主要臨床特征包括:身材矮小,骨骼疼痛,牙齒發(fā)育不良,下肢發(fā)育畸形,兒童佝僂病等。

2、實驗室特征性指標(biāo)主要包括:血磷降低,血鈣正常,堿性磷酸酶明顯升高。大部分XLH病例是由PHEX基因突變導(dǎo)致,該基因是X染色體上與肽鏈內(nèi)切酶同源的磷酸鹽調(diào)控基因(phosphate-regulating gene with homology to endopeptidases on the X chromosome)。我們的研究目的在于鑒定4個中國XLH家系PHEX基因的突變位點,探討XLH發(fā)病的分子遺傳學(xué)機制。
　　方法:以臨床確

3、診的4個家系中7例具有典型癥狀的XLH患者為研究對象,提取4個家系中的7例患者、其他健康家族成員及250例正常志愿者(男性125例,女性125例)的外周血進(jìn)行基因組DNA檢測,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增PHEX基因全部外顯子,其產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。同時對研究對象進(jìn)行實驗室檢查及影像學(xué)檢測。
　　結(jié)果:我們對7例患者進(jìn)行PHEX基因測序后發(fā)現(xiàn),第一個家系中,先證者及其患病的姐姐都攜帶一個位于外顯子15的雜合錯義突變(c.1601C

4、>T),導(dǎo)致534位的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?P534L)。在第二個家系中,先證者及其母親攜帶一個位于外顯子20的雜合插入突變(c.2033dupT),導(dǎo)致自突變位點的堿基均向3’端移動了一位,使得679位蘇氨酸突變?yōu)榻M氨酸,679位之后的第38位成終止密碼子,提前終止了翻譯過程(T679Hfs38X)。在第三個家系中,先證者攜帶一個位于外顯子11的無義突變(c.1294A>T),導(dǎo)致432位賴氨酸突變?yōu)榻K止密碼子(K432X)。在第四個家

5、系中,先證者及其患病的父親都攜帶一個位于外顯子22的雜合錯義突變(c.2192T>C),導(dǎo)致731位苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸(F731S)。通過檢索突變數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),p.T679H、p.K432X、p.F731S均為新突變。另外,我們分析了13種不同物種的PHEX基因序列后發(fā)現(xiàn),在534位點和731位點,這13種物種的序列完全一致,為保守序列。P534L、T679H、K432X和F731S均未在健康家庭成員及250個正常對照中檢測到。

6、　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)的PHEX基因 p.T679H、p.K432X、p.F731S突變是新突變,是引起 XLH的主要原因。我們的發(fā)現(xiàn)有助于了解中國 XLH患者的基因遺傳基礎(chǔ),豐富XLH的基因型-表型譜,PHEX基因突變分析對XLH的早期分子診斷和治療具有重要的臨床意義。
　　第二部分多發(fā)性骨軟骨瘤EXT1和EXT2基因突變篩查
　　目的:多發(fā)性骨軟骨瘤(Multiple osteochondromas, MO)是一種以多發(fā)性

7、外生骨疣為特征的常染色體顯性遺傳性骨病,發(fā)病率大約為1-2/100000。外生骨疣通常在出生后開始形成,隨著骨的生長,其大小及數(shù)量逐漸增加,直至骨骺閉合。在這類患者中,外生骨疣常生長于多個關(guān)節(jié)或同一個關(guān)節(jié)的多個部位。絕大部分多發(fā)性骨軟骨瘤的患者是由于Exostosin-1(EXT1)和Exostosin-2(EXT2)基因突變所致。在本研究中,我們的研究目的在于鑒定10個中國MO家系EXT1和EXT2基因的突變位點,探討MO發(fā)病的分子遺

8、傳學(xué)機制。
　　方法:以臨床確診的,具有典型MO臨床表現(xiàn)的10個中國家系的46例患者為研究對象,提取全部家系中的12位患者、其他健康家族成員及250例正常志愿者的外周血進(jìn)行基因組DNA檢測,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增EXT1和EXT2基因全部外顯子,產(chǎn)物進(jìn)行直接測序,同時對研究對象行影像學(xué)檢測。
　　結(jié)果:我們對12例患者進(jìn)行EXT1和EXT2基因測序,發(fā)現(xiàn)共有9個不同位點的突變,其中EXT1基因中有5個,EXT2基因中

9、有4個。家系1,先證者攜帶有EXT1基因外顯子1的無義突變:p.Gln27X(c.79C>T)。家系2,先證者同時攜帶EXT1基因外顯子1的移碼突變:p.Asn173LysfsX16(c.518dupA)和EXT2基因外顯子9的兩個錯義突變:p.Gln452Lys(c.1354C>A)和p.Ile473Asn(c.1418T>A);先證者母親攜帶EXT2基因外顯子9的錯義突變:p.Ile473Asn(c.1418T>A)。家系4,先證者

10、攜帶EXT1基因外顯子1的移碼突變:p.Leu272ArgfsX4(c.815delT)。家系5,先證者攜帶 EXT2基因外顯子2的無義突變:p.Gln44X(c.130C>T)。家系7,先證者攜帶EXT2基因外顯子8的無義突變:p.Trp396X(c.1187G>A)。家系8,先證者攜帶EXT1基因外顯子9的無義突變:p.Tyr592X(c.1776C>A)。家系10,先證者及其母親共同攜帶 EXT1基因外顯子2的錯義突變:p.Arg

11、340His(c.1019G>A)。而在家系3、6及9中未發(fā)現(xiàn)有突變基因。上述突變基因均未在健康家庭成員及250個正常對照者中檢測到。
　　結(jié)論:我們發(fā)現(xiàn)EXT1基因突變中:p.Gln27X,p.Asn173LysfsX16,p.Leu272ArgfsX4和EXT2基因突變中:p.Ile473Asn,p.Gln452Lys,p.Gln44X是新突變。家系2中EXT1基因突變:p.Asn173LysfsX16和EXT2基因突變:p.

12、Gln452Lys,家系8中EXT1基因突變:p.Tyr592X是新生突變。我們的發(fā)現(xiàn)有助于擴展EXT1和EXT2的基因突變譜,便于深入了解中國多發(fā)性骨軟骨瘤患者的基因遺傳基礎(chǔ)。
　　第三部分軟骨發(fā)育不全FGFR3基因突變篩查
　　目的:軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia,ACH)是人類短肢型侏儒癥中最常見的類型,發(fā)病率約為1/15000-1/77000,是一種常染色體顯性遺傳性疾病,大多數(shù)病例為散發(fā)。受累個體常因四

13、肢肢根型短小而導(dǎo)致軀體矮小。臉部特征主要包括額面部隆起,面中部發(fā)育不全。另外有明顯的腰椎前凸,肘關(guān)節(jié)伸直障礙,雙膝內(nèi)翻,三叉手畸形等。該病主要是由位于人類4號染色體p16.3的纖維母細(xì)胞生長因子-3(Fibroblast growth factor receptor-3 FGFR3)基因突變導(dǎo)致,該染色體包括19個外顯子,編碼806個堿基。本研究目的在于分析5個中國家系中患有軟骨發(fā)育不全的患者,鑒定是否存在FGFR3基因的常見突變位點,

14、探討該病的分子遺傳學(xué)機制。
　　方法:以確診的具有典型臨床癥狀的5個無親緣關(guān)系的軟骨發(fā)育不全家系為研究對象。提取患者、其他健康家族成員及250例正常健康志愿者外周血進(jìn)行基因組DNA檢測,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增FGFR3基因全部外顯子區(qū)域,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。同時對研究對象行影像學(xué)檢測。
　　結(jié)果:我們對患者進(jìn)行FGFR3基因測序后發(fā)現(xiàn)其均攜帶一個位于外顯子9的雜合錯義突變(c.1138G>A),導(dǎo)致380位甘氨