羅漢果蛋白酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、羅漢果（Siraitia grosvenorii）是我國(guó)特有的植物，主產(chǎn)于廣西桂林，在醫(yī)藥、食品、保健等方面應(yīng)用廣泛，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)都受到極大的歡迎。但目前對(duì)羅漢果的加工利用僅僅局限于果實(shí)中少數(shù)幾種成分，而其它許多有用成分并沒(méi)得到充分利用，這既浪費(fèi)了資源又給環(huán)境造成很大污染。此外，蛋白酶是目前工業(yè)用酶的三大主要酶制劑之一，在食品、化工、醫(yī)療、制藥等方面應(yīng)用廣泛。而有限的蛋白酶源與逐年上升的市場(chǎng)需求相比已呈緊缺之勢(shì)，因此有效地開(kāi)發(fā)新的蛋白酶

2、源已經(jīng)迫在眉睫。 本論文在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)羅漢果蛋白酶的分離純化、性質(zhì)、應(yīng)用以及提取工藝等方面進(jìn)行了深入的研究，以便更全面地了解羅漢果蛋白酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和特點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)新的蛋白酶源和有效地綜合利用我國(guó)特有的羅漢果資源提供一定的科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下： 一、羅漢果蛋白酶的分離純化。以鮮羅漢果為原料，經(jīng)洗凈，去皮，粉碎，勻漿，離心去渣，得羅漢果汁，再經(jīng)50％飽和度硫酸銨鹽析，沉淀透析，冷凍干燥得羅漢果粗酶。粗酶

3、通過(guò)CM Sepharose FF離子交換、Sepahcryl S-200 HR凝膠過(guò)濾、Sepahcryl S-100 HR凝膠過(guò)濾柱層析分離，得到純化的羅漢果蛋白酶，再將其進(jìn)行SDS-PAGE和凝膠過(guò)濾HPLC分析均顯示單一的蛋白質(zhì)條帶或蛋白質(zhì)峰。純化后蛋白酶的酶比活為9.4×107U/g，與果汁相比蛋白酶活性回收率為4.2％，提純倍數(shù)為31倍。 二、羅漢果蛋白酶的性質(zhì)研究。由分離純化得到的蛋白酶，經(jīng)凝膠HPLC測(cè)定其純度在

4、98％以上，SDS-PAGE和Sephacryl S-100凝膠過(guò)濾柱層析測(cè)定蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為37100D和38200D。蛋白酶的活性在pH12時(shí)最大，可將該酶歸類為堿性蛋白酶。紫外光譜顯示酶在220nm和280nm處有強(qiáng)吸收，推測(cè)在酶分子中可能存在含苯環(huán)側(cè)鏈的氨基酸殘基。其它酶活性測(cè)定顯示該酶不具有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、過(guò)氧化物酶、淀粉酶及脂肪酶活性。此外，大豆胰蛋白酶抑制劑不能抑制該蛋白酶的活性，這也說(shuō)明該蛋白酶不屬于

5、胰蛋白酶。為了探索羅漢果蛋白酶活性所必需的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，實(shí)驗(yàn)用對(duì)不同的氨基酸殘基有專一性作用的各種化學(xué)修飾劑與羅漢果蛋白酶反應(yīng)，結(jié)果顯示羥基、吲哚基和咪唑基的修飾對(duì)羅漢果蛋白酶活性有很大的抑制作用。進(jìn)一步用酪蛋白作底物保護(hù)蛋白酶中的羥基、吲哚基和咪唑基，以使它們不被修飾，結(jié)果顯示蛋白酶活性與保護(hù)前的酶活性相比有很大的提高。由此確定羥基、吲哚基和咪唑基參與了羅漢果蛋白酶和酪蛋白底物的結(jié)合，為羅漢果蛋白酶的活性必需基團(tuán)。 三、金屬

6、離子、化學(xué)試劑和表面活性劑對(duì)蛋白酶活性的影響。在常見(jiàn)金屬離子中，Cu2+ 對(duì)蛋白酶活性影響最大，5mmol/L的Cu2+能使酶活性降低到原來(lái)的25.8％，此外Al3+、Ni2+、Mn2+也能部分抑制該酶的活性，而其它金屬離子對(duì)酶活性沒(méi)有大的影響，相反Fe3+和Mg2+能激活酶的活性。 0.02％的SDS 和0.1％的Triton X-100、吐溫80、聚乙二醇和乙二醇對(duì)有酶活性有不同的抑制作用，其中0.01％Triton X-1

7、00對(duì)該酶活性影響最大，作用后活性僅保留57％；Na2B4O7?10H2O對(duì)酶活性有很大的增強(qiáng)，作用后使酶活性提高0.86倍，其它常見(jiàn)化學(xué)試劑和表面活性劑或增稠劑對(duì)酶活性沒(méi)有明顯的影響。 四、羅漢果蛋白酶的對(duì)其它蛋白質(zhì)的水解作用和儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)酪蛋白有很好的底物專一性相比，羅漢果蛋白酶幾乎不水解牛白蛋白、卵蛋白和胰蛋白，但對(duì)明膠、溶菌酶有一定的水解活性。 羅漢果蛋白酶的穩(wěn)定性研究表明，干燥、避光、低溫

8、儲(chǔ)存和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％半胱氨酸的添加都有利于羅漢果蛋白酶的穩(wěn)定，20％的葡萄糖對(duì)儲(chǔ)存三個(gè)星期后羅漢果蛋白酶的穩(wěn)定有很好的保護(hù)作用。EDTA對(duì)羅漢果蛋白酶活性有一定抑制作用，但在儲(chǔ)存75天后對(duì)酶活性有一定的穩(wěn)定作用，以1％的濃度效果更佳。 五、羅漢果蛋白酶的提取工藝研究。以廣西融安和荔蒲的不同生長(zhǎng)期的鮮羅漢果為研究對(duì)象，羅漢果所含的蛋白質(zhì)和蛋白酶活性隨著生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在一定的時(shí)間都有一個(gè)峰值，表現(xiàn)在不同的生長(zhǎng)期，然后逐漸下將

9、，而蛋白酶的比活力并沒(méi)表現(xiàn)出明顯的規(guī)律。 新鮮羅漢果經(jīng)洗凈，破碎，水提，離心去渣，得到羅漢果汁，再經(jīng)100nm陶瓷膜過(guò)濾和10,000D有機(jī)膜分離后，收集截留液經(jīng)噴霧干燥得到產(chǎn)品羅漢果粗酶。經(jīng)測(cè)定：與果汁相比，羅漢果蛋白酶活性回收率為45.4％，提純倍數(shù)為2.67倍，濃縮了近6倍，噴霧干燥后酶活性沒(méi)有明顯變化。該工藝簡(jiǎn)單易行，分離快速，濃縮度和酶活性回收率都較高，對(duì)羅漢果蛋白酶的大規(guī)模生產(chǎn)和羅漢果的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了一定的參考價(jià)