左卡尼汀對高滲鹽水誘導的小鼠干眼模型眼表保護作用的初步研究.pdf

1、背景與目的：干眼病(dry eye disease)，又稱角結膜干燥癥(keratoconjunctivitis sicca)或者淚液功能不全綜合征(dysfunctional tear syndrome)，是指任何原因引起的淚液質和量異常或動力學異常導致的淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適，導致眼表組織病變?yōu)樘卣鞯募膊】偡Q，是最常見的眼表疾病。干眼病嚴重影響患者的生活質量。干眼病患者的淚液滲透壓顯著升高，其滲透壓為(326±22.1)mO

2、smol/L，正常人淚液滲透壓為(302±9.7)mOsmol/L。用316 mOsmol/L作為干眼病的診斷指標，其敏感性和特異性優(yōu)于任何其它的干眼病診斷指標。
　　 目前干眼病的治療以人工淚液滴眼為主，通過提高淚膜穩(wěn)定性，在一定程度上能緩解干眼病患者臨床癥狀和體征，但對中、重度干眼病的治療效果不佳。自體血清作為有效的淚液替代物，無防腐劑、無抗原性，能促進結膜、角膜上皮增殖分化而應用于中、重度干眼病的治療，但其保存受限。因此，

3、從干眼病發(fā)病機制出發(fā)，研發(fā)一種有效治療干眼病的藥物并應用于臨床是急待解決的問題。
　　 左卡尼汀是一種極性分子。文獻證實，左卡尼汀具有滲透保護的作用。哺乳動物眼表組織中，左卡尼汀在晶狀體中濃度最高，在玻璃體中濃度最低，兔的雙眼局部應用左卡尼汀膏劑后，角膜中左卡尼汀含量顯著增加。Pescosolido等證實人的淚液中存在左卡尼汀及其衍生物，干眼病患者淚液中左卡尼汀濃度顯著下降，作者建議使用含左卡尼汀成分的滴眼液來緩解干眼病患者眼表

4、上皮細胞的損害。研究表明，左卡尼汀對高滲(400mOsmol/L)培養(yǎng)基中的角膜上皮細胞具有滲透保護的作用。左卡尼汀作為生理性補充或藥物在眼科的研究中證實，1%濃度為其最佳劑量。目前，局部應用左卡尼汀對干眼病角膜和結膜上皮細胞是否具有保護作用尚未見文獻報道。
　　 本實驗在課題組前期高滲鹽水點眼制作小鼠干眼模型的基礎上，初步探討局部應用左卡尼汀是否具有減緩小鼠干眼模型眼表損害的作用。
　　 方法：
　　 1.動物

5、的選擇與分組6～8周齡雌性BALB/c小鼠60只，隨機數字表法分為高滲鹽水滴眼組(HO組)，高滲聯合等滲鹽水滴眼組(HO+IO組)，高滲鹽水聯合1%左卡尼汀滴眼組(HO+1%LCA組)。每組20只，雙眼取用。對HO組采用500mOsmol/L氯化鈉溶液滴眼，每天5次；對HO+IO組，先滴308mOsmol/L氯化鈉溶液，30min后，再滴500mOsmol/L氯化鈉溶液，每天各滴眼5次；對HO+1%LCA組，先滴1%左卡尼汀滴眼液，30

6、min后，再滴500mOsmol/L氯化鈉溶液，每天各滴眼5次。持續(xù)滴眼28天。
　　 2.1%左卡尼汀滴眼液的制備：左卡尼汀粉劑溶于注射用水，氯化鈉粉劑調節(jié)滲透壓至308mOsmol/L，鹽酸調節(jié)pH值至7.0。
　　 3.淚液分泌量的測定采用SchirmerⅠ方法測定BALB/c小鼠淚液的分泌量。在裂隙燈顯微鏡下，使用顯微鑷夾住酚紅棉線，放置于BALB/c小鼠眼睛的外眥部，60s后取出，用毫米刻度尺測量酚紅棉線濕潤的

7、長度。
　　 4.角膜熒光素染色與評分用微量加液器在BALB/c小鼠下方結膜囊內滴入1ul5%熒光素鈉溶液，3min后，裂隙顯微鏡下用鈷藍光進行檢查，并照相記錄。
　　 5.淚液蕨類實驗采用自制毛細玻璃管采集BALB/c小鼠下穹隆部淚液，涂在潔凈的載玻片上，室溫干燥，在48h內光學顯微鏡下進行蕨類結晶圖像分析，并照相記錄。
　　 6.角膜和結膜上皮的組織學觀察采用蘇木精伊紅染色在光學顯微鏡下觀察角膜上皮形態(tài)。采用

8、圖像分析軟件測量中央角膜上皮厚度。取上方穹窿部結膜，采用過碘酸-Schiff染色，在光學顯微鏡下觀察上方穹窿部結膜上皮的形態(tài)。計算每個高倍視野下杯狀細胞數量。
　　 7.掃描電子顯微鏡觀察第28天在掃描電子顯微鏡下觀察角膜上皮表面的形態(tài)。
　　 8.淚液滲透壓測定首先建立BALB/c小鼠淚液滲透壓測定值轉化表。在實驗第0、28天收集小鼠淚液，冰點滲透壓儀測定淚液滲透壓值，依據建立的BALB/c小鼠淚液滲透壓測定值轉化表進

9、行淚液滲透壓的換算。
　　 9.統(tǒng)計學分析方法采用Kruskal-Wallis H檢驗比較角膜熒光素染色評分。采用完全隨機設計資料的方差分析和LSD-t比較中央角膜上皮厚度、淚液的分泌量、杯狀細胞數量、淚液滲透壓值。
　　 結果：
　　 1.淚液分泌量的測定第0、7天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組的酚紅棉線浸濕長度的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第14、28天，三組的酚紅棉線浸濕長度的差異出現統(tǒng)計

10、學意義(P<0.05)，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組酚紅棉線浸濕長度顯著性下降，而HO組與HO+IO組兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 2.角膜熒光素染色與評分第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組角膜上皮熒光素染色均有少許點狀著色，三組之間角膜熒光素染色評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著實驗進展，HO組、HO+IO組角膜鼻側象限點狀著色增加，漸呈現片狀著色，病變逐漸發(fā)展累及角膜各個

11、象限，以角膜中央為重。第14天起，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組角膜熒光染色評分顯著上升。第14、28天，三組之間角膜熒光素染色評分出現顯著性差異(P<0.01)。
　　 3.淚液蕨類實驗第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組BALB/c小鼠淚液在光學顯微鏡下可以觀察到形態(tài)良好的蕨類物。HO組、HO+IO組BALB/c小鼠淚液的結晶中蕨類物自第7天起逐漸減少，蕨類物之間的連接中斷。而同一時間點，HO+1%LC

12、A組較HO組、HO+IO組蕨類物形態(tài)保持良好。
　　 4.角膜上皮的HE染色觀察和角膜上皮厚度的測量第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組角膜HE染色觀察可見上皮分層良好，分4或5層，基底部的細胞呈柱狀排列，向角膜表層分化逐漸變成鱗狀上皮細胞，三組之間中央角膜厚度測量值無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。隨實驗進展，HO組、HO+IO組角膜上皮表層細胞出現增生，細胞層數增多，角膜上皮厚度增加。第7天起，HO組、HO+IO組、

13、HO+1%LCA組三組之間中央角膜上皮厚度測量值出現顯著性差異(P<0.01)。第7、14、28天，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組中央角膜上皮層厚度明顯增加。
　　 5.結膜組織的PAS染色觀察和杯狀細胞計數第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組結膜上穹窿部包含多層上皮細胞，形態(tài)呈圓柱狀或骰狀，杯狀細胞廣泛分布于穹窿部上皮細胞之間，三組之間結膜杯狀細胞計數差異無統(tǒng)計學意義(P=0.538)。隨實驗進展，HO組

14、、HO+IO組結膜上穹窿部上皮細胞排列紊亂，出現缺失，杯狀細胞形態(tài)不一致，數量減少。第7天起，三組之間杯狀細胞數量出現顯著性差異(P<0.01)。第7、14、28天，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組杯狀細胞數量明顯減少，出現顯著性差異，而HO組與HO+IO組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 6.掃描電子顯微鏡觀察第0天，角膜表面上皮細胞的掃描電子顯微鏡觀察可見，上皮細胞呈多邊形，形態(tài)良好，細胞表面可見大量

15、微絨毛，細胞間緊密連接。第28天，HO組、HO+IO組絕大多數角膜表層細胞脫落，暴露第二層細胞，顯露膨脹的細胞核，微絨毛大量的脫落。第28天，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組角膜表面微絨毛明顯減少。
　　 7.淚液滲透壓測定建立BALB/c小鼠淚液滲透壓測定值轉化表。實驗第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組三組之間淚液滲透壓測定值差異無統(tǒng)計學意義(P=0.712)。第28天，HO組、HO+IO組、HO+1%L

16、CA組三組之間淚液滲透壓測定值出現顯著性差異(P=0.000)，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組淚液滲透壓值升高，出現顯著性差異，而HO組與HO+IO組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1.局部應用左卡尼汀具有減緩小鼠干眼模型眼表損害的作用。
　　 2.左卡尼汀可能通過滲透調節(jié)作用，對高滲鹽水誘導的小鼠干眼模型眼表起保護作用。
　　 3.局部應用含左卡尼汀及其衍生物的