鞘內(nèi)注射不同濃度羅哌卡因在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)毒性的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 觀察鞘內(nèi)注射不同濃度的羅哌卡因及其在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠脊髓、神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)的影響，并探討P38磷酸化及線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑是否參與羅哌卡因的脊髓神經(jīng)毒性，為臨床上安全使用羅哌卡因提供理論依據(jù)。 方法： 1、改良Yaksh法鞘內(nèi)置管成功的雄性SD大鼠30只，體重為250-320g，隨機(jī)分為生理鹽水組（N1組，n=6）、羅哌卡因組（R1組），而R1組大鼠鞘內(nèi)分別注入0.25％、0.5％、0.75％、1.0％羅哌

2、卡因0.12μl/g，間隔1.5h給藥1次，持續(xù)給藥48h，分別記為“R0.25組、R0.5組、R0.75組、R1.0組”（n=6），N1組則給予等量的生理鹽水，給藥方式與R1組一樣；另取改良Yaksh法暴露寰枕膜后不置管的6只雄性SD大鼠，體重為250-320g，記為假手術(shù)組（S1組，n=6），S1組不給藥。通過(guò)分別檢測(cè)給藥前和最后1次給藥1.5h后各組大鼠后爪機(jī)械刺激回縮閾值（即機(jī)械痛閾）、熱刺激回縮閾值（即熱痛閾）的最大效應(yīng)百分比

3、以及最后1次給藥后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分來(lái)觀察其行為學(xué)的變化；在完成行為學(xué)檢測(cè)后處死大鼠，取脊髓腰膨大及相應(yīng)節(jié)段神經(jīng)根行光鏡和電鏡檢查，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分；TUNEL法檢測(cè)脊髓組織細(xì)胞凋亡；PT-PCR法檢測(cè)脊髓組織caspase-3，9，8 mRNA的表達(dá)；Western Blot法檢測(cè)脊髓組織磷酸化p38、活化caspase-3蛋白表達(dá)及胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C釋放情況。 2、改良Yaksh法鞘內(nèi)置管成功的雄性SD大鼠30只，體重為250-32

4、0g，隨機(jī)分為對(duì)照組（N2組，n=6）、羅哌卡因組（R2組）。R2組鞘內(nèi)注射0.75％羅哌卡因0.12μl/g，間隔1.5h給藥1次，分別持續(xù)給藥12h、24h、36h、48h，記為“R12組、R24組、R36組、R48組”（n=6）。通過(guò)監(jiān)測(cè)R2組大鼠給藥前和最后1次給藥1.5h后機(jī)械痛閾、熱痛閾的最大效應(yīng)百分比及最后1次給藥后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分來(lái)觀察其行為學(xué)的變化，并在完成行為學(xué)檢測(cè)后處死大鼠；N2組則不給藥，監(jiān)測(cè)N2組給藥前及R2組大鼠

5、第1次給藥時(shí)的機(jī)械痛閾、熱痛閾的最大效應(yīng)百分比，并在完成行為學(xué)檢測(cè)后處死；各組大鼠處死后取脊髓腰膨大組織及相應(yīng)節(jié)段神經(jīng)根與第一部分進(jìn)行相同的檢測(cè)。 3、將PC12細(xì)胞分為三組：對(duì)照組（N3）：不予任何特殊處理，常規(guī)培養(yǎng)48h；羅哌卡因組（R組）：15mmol/L羅哌卡因處理48h；羅哌卡因+p38抑制劑SB203580組（R+S組）：15mmol/L羅哌卡因+10μmol/L p38特異性抑制劑SB203580處理48h。檢測(cè)干

6、預(yù)后各組細(xì)胞計(jì)數(shù)以及MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率的變化，Western Blot法檢測(cè)磷酸化p38、活化caspase-3蛋白表達(dá)及胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C釋放的情況。 結(jié)果： 1、各組大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾的最大效應(yīng)百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），R1各組大鼠每次注藥后30s內(nèi)出現(xiàn)雙后肢的麻痹，R0.25組雙后肢恢復(fù)最快（P<0.05），R1.0組雙后肢恢復(fù)最慢（P<0.05），R0.5組和R0.75組，介于兩者其中；電鏡結(jié)果顯示

7、：R0.5組線粒體結(jié)構(gòu)模糊，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，部分有髓神經(jīng)纖維髓鞘板層結(jié)構(gòu)疏松；R0.75組線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕中度擴(kuò)張，少數(shù)神經(jīng)元的胞核出現(xiàn)固縮，有髓神經(jīng)纖維的板層結(jié)構(gòu)疏松；R1.0組線粒體呈空泡樣變性；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極度擴(kuò)張，神經(jīng)元細(xì)胞核皺縮、甚至裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，髓鞘增厚，甚至崩解消失；R0.75與R1.0組的組織病理學(xué)損傷評(píng)分、TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞較Nl組高，（P<0.05）；R0.5、R0.75、R1.0組

8、的caspase-3、9的mRNA表達(dá)以及磷酸化p38、活化caspase-3的蛋白表達(dá)、胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放較N1組高（P<0.05）； 2、與N2組比較，R12、R24、R36、R48組大鼠給藥前后熱痛閾和機(jī)械痛閾的最大效應(yīng)百分比和運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；電鏡結(jié)果顯示：R12與R24組線粒體輕度水腫，少數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕中度擴(kuò)張，髓鞘的板層結(jié)構(gòu)疏松，R36組和R48組線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、髓鞘板層結(jié)構(gòu)的腫脹程度更為嚴(yán)重

9、，神經(jīng)元胞核出現(xiàn)一定程度的固縮，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)：R36組和R48組大鼠的組織病理學(xué)損傷評(píng)分、TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較N2組高（P<0.05）；R24、R36、R48組大鼠脊髓組織中caspase-3、9mRNA的表達(dá)水平較N2組高（P<0.05）；R12、R24、R36、R48組大鼠脊髓組織中磷酸化p38蛋白的表達(dá)較N2組高，以R12組磷酸化p38水平最高（P<0.05）：而R24、R36、R48組大鼠脊髓組織中活化caspa

10、se-3的蛋白水平、胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放水平較N2組高，以R48組活化caspase-3蛋白和胞質(zhì)中細(xì)胞色素C水平最高（P<0.05）； 3、與N3組相比，R組、R+S組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率均減少（P<0.05），而磷酸化P38、活化caspase-3蛋白表達(dá)以及胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放均增高（P<0.05）；與R組相比，R+S組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率均增高（P<0.05），磷酸化p38、活化caspase-3蛋白表達(dá)及胞質(zhì)中

11、細(xì)胞色素C的釋放均減少（P<0.05）。 結(jié)論： 1、鞘內(nèi)注射0.5％，0.75％，1.0％的羅哌卡因48小時(shí)的大鼠脊髓和神經(jīng)根產(chǎn)生濃度依賴性的超微結(jié)構(gòu)改變，其中0.75％，1.0％羅哌卡因引起的組織病理學(xué)改變較對(duì)照組重，同時(shí)產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞較對(duì)照組多。 2、鞘內(nèi)注射0.75％的羅哌卡因24h，36h，48h可使大鼠脊髓和神經(jīng)根產(chǎn)生時(shí)間依賴性的超微結(jié)構(gòu)改變，超過(guò)36h可使脊髓組織病理學(xué)改變較對(duì)照組重，同時(shí)產(chǎn)生的凋亡