CO-,2-氣腹對胃癌細胞生物學特性及侵襲轉移能力影響的臨床與基礎研究.pdf

1、目的：胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，也是最易發(fā)生腹腔種植轉移的惡性腫瘤，目前手術切除仍然是治療胃癌最有效的方法。近年來，由于微創(chuàng)外科的發(fā)展，特別是其創(chuàng)傷小、出血少、術后恢復快等微創(chuàng)特點使其逐步深入腹部外科的各個領域。腹腔鏡結直腸癌手術已經(jīng)被證實具有與開腹手術相當甚至優(yōu)于開腹手術的早期和遠期療效。但由于腹腔鏡胃癌手術開展較晚，隨機對照研究病例較少，目前尚處于探索階段。在這一背景下，西南醫(yī)院普通外科于2004年成立微創(chuàng)胃腸外科中心，

2、系統(tǒng)研究腹腔鏡胃癌根治術的技術方法和臨床應用可行性。本研究一方面從臨床病例入手，通過檢測腹腔鏡胃癌根治術對腹腔脫落胃癌細胞和腹膜超微結構的影響，探討腹腔鏡手術是否會促進胃癌細胞的脫落和種植。另一方面，我們于體外建立人工氣腹模型，設立不同種類、不同壓力氣腹環(huán)境，通過對氣腹環(huán)境下胃癌細胞增殖活性、細胞周期、凋亡比例、遷移運動、細胞骨架以及裸鼠移植瘤的研究，探討CO2氣腹對胃癌細胞生物學特性和侵襲轉移能力的影響。最后，檢測不同壓力CO2氣腹下

3、胃癌細胞細胞周期蛋白和凋亡相關基因的表達變化，對其分子機制進行初步探討。 方法：(1)收集同期開展的腹腔鏡胃癌和開腹胃癌手術病人腹腔沖洗液，應用細胞學和熒光定量PCR法檢測腹腔脫落游離癌細胞和CEA mRNA。再獲取腹腔鏡胃癌和開腹胃癌手術病人腹膜和胃漿膜標本，常規(guī)固定制樣，掃描電鏡觀察其超微結構改變。(2)建立體外人工氣腹模型，分別以CO2和混合氣體作為膨腹介質，設定壓力為0、10、12和15mmHg。分別應用MTT酶標儀、流

4、式細胞儀、Boyden小室和免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測不同種類、不同壓力氣腹環(huán)境對胃癌MKN-45細胞增殖活性、細胞周期、凋亡比例、遷移運動和細胞骨架的影響。(3)將不同種類、不同壓力環(huán)境下培養(yǎng)的MKN-45細胞接種于裸鼠皮下，觀察裸鼠移植瘤成瘤時間、腫瘤大小和Ki-67表達變化。(4)分別應用RTl-PCR、Western-blot、免疫沉淀、免疫組化方法檢測不同壓力CO2氣腹對胃癌MKN-45細胞Cyclin D1、CDK4、Rb

5、、磷酸化Rb、Bcl-2/Bax以及Cyclin D1和CDK4結合能力的影響。 結果：(1)腹腔鏡胃癌根治術組和開腹胃癌根治術組腹腔游離胃癌細胞的檢出率和CEA mRNA陽性率無顯著差異(P>0.05)；腹腔游離癌細胞檢出率與腫瘤浸潤深度、漿膜受侵面積、淋巴結轉移和TNM分期密切相關。腹腔鏡胃癌根治術組腹膜間皮細胞腫脹、細胞間隙增寬，而開腹胃癌根治術組腹膜間皮細胞形態(tài)無明顯改變、細胞間連接緊密。兩組胃漿膜超微結構無顯著差異。(

6、2)CO2氣腹組胃癌MKN-45細胞培養(yǎng)液pH值下降非常顯著，且壓力越大pH值降低越明顯。混合氣體組胃癌MKN-45細胞培養(yǎng)液pH值與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。(3)0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組和0、10、12.mmHg CO2氣腹組與對照組比較增殖活性無顯著性差異(P>0.05)，15mmHg CO2氣腹組增殖活性在前3天無顯著性差異，在4～7天下降非常顯著(P<0.01)。15mmng CP2氣腹組胃癌M

7、KN-45細胞增殖指數(shù)與對照組比較顯著下降(P<0.05)，凋亡比例增加非常顯著(P<0.01)，而0、10、12 mmHg CO2氣腹組和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。(4)15mmHg CO2氣腹組胃癌MKN-45細胞穿過濾膜數(shù)量與對照組比較顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)-actin表達明顯減少，結構松散，微管蛋白β-tubulin表達較對照組減弱、稀疏。而0、10、12 mmHg

8、CO2氣腹組和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。(5)15mmHg CO2氣腹組胃癌MKN-45細胞Cyclin D1、CDK4在mRNA和蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，二者結合能力也顯著下降(P<0.05)。Rb蛋白在mRNA和蛋白水平與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，但磷酸化Rb蛋白則顯著低于對照組(P<0.05)。免疫組化染色顯示Bcl-2/Bax表達在15mmHg

9、CO2氣腹組明顯低于對照組和0、10、12 mmHg CO2氣腹組(P<0.05)。(6)15mmHg CO2氣腹組裸鼠移植瘤體積、重量、Ki-67陽性率與對照組比較顯著下降(P<0.05)，0、10、12 mmHg CO2氣腹組和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。 結論：(1)腹腔鏡胃癌根治術與開腹胃癌根治術比較并不增加腹腔游離胃癌細胞的檢出率，腹腔游離胃癌細胞檢出率與腫瘤浸潤

10、深度、漿膜受侵面積、淋巴結轉移和TNM分期密切相關。(2)腹腔鏡胃癌根治術CO2氣腹對壁層腹膜影響較大，主要表現(xiàn)在間皮細胞腫脹、細胞間連接斷裂、細胞間隙增寬、基底層組織暴露，而對胃壁漿膜影響較小。(3)0、10、12mmHg CO2氣腹和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹對胃癌MKN-45細胞增殖活性、增殖指數(shù)凋亡比例的影響與對照組比較無顯著差異。15mmHg CO2氣腹顯著降低胃癌MKN-45細胞的增殖活性、增殖指數(shù)，增加其凋亡

11、比例。(4)15mmHg CO2氣腹抑制胃癌MKN-45細胞的遷移運動能力。在15mmHg CO2氣腹環(huán)境下胃癌MKN-45細胞的微絲微管表達減弱、結構松散、排列混亂，這可能是其運動能力減弱的因素之一。(5)0、10、12mmHg CO2氣腹和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹對胃癌MKN-45細胞裸鼠移植瘤成瘤時間、腫瘤體積、腫瘤重量無顯著影響，而15mmHg CO2氣腹可以顯著延長裸鼠移植瘤成瘤時間，抑制腫瘤體積和重量。同時，