抑制成纖維細(xì)胞PTEN基因的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)影響.pdf

1、第一部分：
　　 靶向PTEN的shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建靶向PTEN基因的短發(fā)卡RNA（shRNA）表達(dá)載體，并探討該表達(dá)載體對(duì)目的基因PTEN的沉默效果。
　　 方法：設(shè)計(jì)兩條PTEN特異性shRNA編碼序列和一條非特異性陰性對(duì)照序列，插入質(zhì)粒pSilencer 2.1-U6 hygro中，進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞系HELF細(xì)胞,同時(shí)以陰性

2、對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照和無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞分別作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)照和空白對(duì)照,采用RT-PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡法（Western Blotting）檢測(cè)PTEN在mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)變化.
　　 結(jié)果：測(cè)序結(jié)果和酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)證實(shí)成功構(gòu)建了PTEN的shRNA真核表達(dá)載體。RT-PCR及Western Blotting結(jié)果顯示：兩條含有PTEN shRNA的質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染入HELF細(xì)胞后在mRNA

3、水平及蛋白水平均能明顯的抑制PTEN的表達(dá)，其中以第二條即shRNA-PTEN2抑制效果最為明顯。
　　 結(jié)論：成功的構(gòu)建了PTEN特異性shRNA真核表達(dá)載體,經(jīng)鑒定其在成纖維細(xì)胞中具有干擾PTEN基因表達(dá)的功能，為進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞中的PTEN基因表達(dá)在腫瘤形成和發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：
　　 攜帶PTEN shRNA質(zhì)粒的HELF對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231生物學(xué)特性的影響

4、　　 目的：探討PTEN基因表達(dá)受抑的成纖維細(xì)胞(HELFPTEN-)與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231共培養(yǎng)時(shí)，乳腺癌細(xì)胞在增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移上的生物學(xué)變化，揭示腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤生物學(xué)特性影響的部分機(jī)制。
　　 方法：將HELFPTEN-與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231共培養(yǎng)。（1）通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行Ki67檢測(cè)，檢測(cè)共培養(yǎng)體系對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響；（2）5-FU誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，

5、通過(guò)Annexin V/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)體系對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抗凋亡能力的影響；（3）通過(guò)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)基中MMP蛋白的表達(dá)變化以及MMP活性率的改變；（4）通過(guò)Transwell小室法，明確共培養(yǎng)體系對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移能力的影響；（5）用Matrigel模擬并重建基底膜，通過(guò)Transwell小室法，建立成纖維細(xì)胞HELFPTEN-與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的交互作用模型，觀察

6、 HELFPTEN-對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　 結(jié)果：（1）與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231其Ki67表達(dá)較空白培養(yǎng)組和“HELF+MDA-MB-231”細(xì)胞共培養(yǎng)組顯著增高(p<0.05)。（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231具有拮抗5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用，凋亡率明顯低于空白培養(yǎng)組和“HELF+MDA-MB-231”細(xì)胞共培養(yǎng)組 (p<0

7、.05)。（3）明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HELFPTEN-以及乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中MMP蛋白的表達(dá)和MMP活性率均明顯高于空白培養(yǎng)組和“HELF+MDA-MB-231”細(xì)胞共培養(yǎng)組(p<0.05)。（4）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遷移的細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)以下趨勢(shì)：與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231＞“HELF+MDA-MB-231”細(xì)胞共培養(yǎng)組＞MDA-MB-231細(xì)胞普通培養(yǎng)組，其差異具

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。（5）侵襲轉(zhuǎn)移能力比較發(fā)現(xiàn)：與HELFPTEN-共培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231＞“HELF+MDA-MB-231”細(xì)胞共培養(yǎng)組＞MDA-MB-231細(xì)胞普通培養(yǎng)組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 結(jié)論：成纖維細(xì)胞HELF可提升乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移能力，而PTEN表達(dá)受抑的HELF細(xì)胞，對(duì)MDA-MB-231的增殖、抗凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移能力的增