大鼠嗅球神經(jīng)干細胞增殖及誘導分化的實驗研究.pdf

1、目的：建立新生大鼠嗅球神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)體外分離培養(yǎng)方法。通過對不同發(fā)育階段大鼠嗅球NSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學觀察及免疫熒光化學染色結果分析，探討不同發(fā)育階段大鼠嗅球NSCs增殖、分化特性。使用不同濃度的胎牛血清、IGF-Ⅰ和BDNF誘導大鼠嗅球NSCs的分化，探討促進大鼠嗅球NSCs向神經(jīng)元分化的因素，為大鼠嗅球NSCs的深入研究與臨床應用打基礎。 材料與方法：從新生大鼠嗅球組織中分離NSCs

2、，采用神經(jīng)細胞球形成法，以無血清培養(yǎng)液，使用生長因子(bFGF、EGF)，進行體外擴增培養(yǎng)，以機械分離法連續(xù)傳代，相差顯微鏡及電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)，免疫細胞化學法檢測Nestin表達，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法和流式細胞儀檢測大鼠嗅球NSCs的增殖能力。取胎齡18天(embryonicday18,ED18)、出生24h以內(nèi)(postnatalwithin24h,P0)及2月齡(2month,M2)的大鼠嗅球組織行單細胞克隆，免疫熒

3、光化學染色鑒定嗅球NSCs，并計數(shù)分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的比例。用免疫細胞化學染色和流式細胞儀分選細胞法觀察不同濃度的胎牛血清、IGF-Ⅰ和(或)BDNF對嗅球NSCs分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的影響。 結果：光鏡下原代培養(yǎng)見細胞呈大小不一、懸浮生長的細胞團，邊界清晰，折光性好，細胞團中細胞排列較為致密，傳代培養(yǎng)的細胞形態(tài)特點與原代培養(yǎng)無明顯差異，電鏡下嗅球NSCs呈原始細胞的形態(tài)特征，嗅球NSC

4、s在含有生長因子bFGF和EGF的無血清基礎培養(yǎng)液中，能形成大量懸浮的神經(jīng)球，免疫細胞化學鑒定，Nestin抗體標記陽性，MTT比色法和流式細胞儀的結果表明這些干細胞球可在體外擴增及傳代培養(yǎng)。在相同培養(yǎng)條件下，原代培養(yǎng)6h時，各組細胞數(shù)量及形態(tài)無明顯區(qū)別，7d后，ED18組和P0組懸浮神經(jīng)球數(shù)目無顯著差異，M2組懸浮神經(jīng)球較少，免疫熒光染色結果顯示：ED18和P0段大鼠嗅球NSCs與M2段在增殖、分化特性上存在著明顯差異，統(tǒng)計學分析結果

5、顯示：隨著發(fā)育階段的增長，形成神經(jīng)球的細胞數(shù)量減少，神經(jīng)元分化趨勢減少，但對于星型膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞無明顯影響。在無血清培養(yǎng)液中，嗅球NSCs大多數(shù)分化為神經(jīng)元，而在有血清培養(yǎng)中星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞明顯增加，且星形膠質(zhì)細胞數(shù)量隨血清含量的增多而增多，IGF-Ⅰ+BDNF組NSCs分化最快、最完全，無血清對照組細胞貼壁及分化最慢，IGF-Ⅰ組和IGF-Ⅰ+BDNF組NSE染色陽性細胞均多于無血清對照組，而GFAP染色陽性細胞數(shù)少

6、于無血清對照組(P＜0.05)，CNP陽性細胞數(shù)各組間差異無顯著性。 結論：新生大鼠嗅球可以培養(yǎng)出具有自我增殖和多向分化潛能的NSCs。不同發(fā)育階段的大鼠嗅球內(nèi)均存在著NSCs，它們在體外擴增、傳代，自然分化后表達神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞標記物，嗅球NSCs增殖分化特性在不同發(fā)育階段存在一定的差異，隨著發(fā)育階段的增長，形成神經(jīng)球的細胞數(shù)量減少，神經(jīng)元分化趨勢減少。胎牛血清有助于嗅球NSCs向星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞分