轉(zhuǎn)基因細(xì)胞法測(cè)定重組藥物生物學(xué)活性研究.pdf

1、生物學(xué)活性測(cè)定在重組藥物的研究開發(fā)和質(zhì)量控制中至關(guān)重要。目前的生物活性分析方法主要包括體內(nèi)法（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）和體外法（細(xì)胞與組織實(shí)驗(yàn)）?；诩?xì)胞的分析方法由于其具有操作簡(jiǎn)便，周期短，特異性好，變異度小等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。但許多重組藥物由于藥物作用的組織器官特異性，往往難以獲得適用于活性測(cè)定的穩(wěn)定的高反應(yīng)性細(xì)胞株，而通過(guò)人工改造的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以解決這一難題。
　　本研究的目的是構(gòu)建活性測(cè)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)并應(yīng)用于重組藥物的生物學(xué)活性測(cè)

2、定方法研究，以解決特定重組藥物的測(cè)活難題。本研究?jī)?nèi)容共分為三部分，分別根據(jù)特定藥物的具體作用機(jī)制采用了不同的策略構(gòu)建活性測(cè)定用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。第一部分，導(dǎo)入天然受體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活性測(cè)定方法的建立和應(yīng)用。腦利鈉肽與其天然受體鳥苷酸環(huán)化酶A（GCA）結(jié)合后，可激活其胞內(nèi)區(qū)的鳥苷酸環(huán)化酶活性，催化GTP轉(zhuǎn)化為cGMP。構(gòu)建GCA超表達(dá)的293GCAC3單克隆細(xì)胞株，通過(guò)檢測(cè)cGMP含量的來(lái)測(cè)定重組人腦利鈉肽的生物學(xué)活性。結(jié)果表明，該方法較傳統(tǒng)的

3、兔主動(dòng)脈條法操作簡(jiǎn)便，周期短，變異小，可以作為一種有效的替代方法用于重組人腦利鈉肽的生物活性分析。第二部分，同時(shí)導(dǎo)入天然受體和報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活性測(cè)定方法的建立與應(yīng)用。Byetalog與 GLP-1受體結(jié)合后，可提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，最終激活cAMP反應(yīng)元件（CRE），增強(qiáng)下游基因的表達(dá)。構(gòu)建GLP-1受體和CRE報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染的CHOglp1r/crec14單克隆細(xì)胞株，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)測(cè)定Byetalog的生物學(xué)活性。

4、結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便快速，變異度小，適用于Byetalog的生物學(xué)活性測(cè)定。第三部分，同時(shí)導(dǎo)入融合受體和報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活性測(cè)定方法研究。構(gòu)建VEGFR胞外區(qū)和IFNAR1/2胞內(nèi)區(qū)的融合受體，與IFN反應(yīng)元件（ISRE）報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，VEGF與胞外區(qū)的VEGFR結(jié)合后激活胞內(nèi)的IFN信號(hào)通路，引起ISRE報(bào)告基因高表達(dá)，可以通過(guò)檢測(cè)VEGF單抗對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的抑制作用來(lái)測(cè)定其活性。成功構(gòu)建了融合受體和ISRE