釀酒酵母的比較功能基因組學(xué)研究和遺傳育種.pdf

1、燃料乙醇是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的生物質(zhì)可再生能源，主要通過釀酒酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化淀粉和糖類原料獲得。當(dāng)前，燃料乙醇的生產(chǎn)應(yīng)用仍面臨諸多資源與成本制約因素，主要集中在原料受到土地和水資源限制、生產(chǎn)過程能耗高及廢料處理等難題。針對(duì)燃料乙醇的生產(chǎn)現(xiàn)狀，世界各國學(xué)者和工程技術(shù)人員認(rèn)為高溫發(fā)酵、濃醪發(fā)酵和非糧纖維乙醇三種發(fā)酵技術(shù)是提升燃料乙醇經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益的有效途徑。但這幾種發(fā)酵技術(shù)的運(yùn)用對(duì)釀酒酵母菌株耐受環(huán)境中生長和發(fā)酵抑制因子（如高溫、高滲、高

2、乙醇濃度和纖維原料抑制物乙酸、糠醛及酚類物質(zhì)）的能力提出了更苛刻的要求。研究釀酒酵母對(duì)這些脅迫因子的耐性機(jī)制，以及選育具高抗逆性和乙醇轉(zhuǎn)化率的釀酒酵母菌株成為了突破這些新發(fā)酵技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵所在，也是一項(xiàng)具有重大理論與實(shí)際應(yīng)用意義的科學(xué)研究課題。本文主要通過比較功能基因組學(xué)研究方法，揭示不同釀酒酵母菌株間的基因組差異，以及這些差異如何影響菌株的耐性和發(fā)酵性能。同時(shí)也利用基因組變構(gòu)和基因工程等方法來選育性能改進(jìn)的釀酒酵母菌株。主要研究內(nèi)容和

3、結(jié)果如下:
　　 1、燃料乙醇工業(yè)菌株的耐受性和發(fā)酵性能比較選取實(shí)驗(yàn)室菌株Z1和乙醇發(fā)酵工業(yè)上常用的釀酒酵母Z2-Z7系列菌株，研究比較其對(duì)高溫等脅迫抑制因子的耐受性及其在高溫、濃醪和纖維素水解液三種條件下的發(fā)酵性能。結(jié)果表明，即便是同一生產(chǎn)用途的釀酒酵母菌株在多種脅迫耐受性和發(fā)酵性能上存在顯著差別、各具優(yōu)勢。相比之下，菌株Z7（ZT系列）在濃醪條件下的乙醇產(chǎn)量和糖醇轉(zhuǎn)化率上要明顯優(yōu)于其它常用工業(yè)菌株，菌株Z5在高溫條件下乙醇產(chǎn)

4、量最高，菌株Z3對(duì)纖維素水解液中抑制物耐性要高于其它菌株。
　　 2、比較功能基因組學(xué)指導(dǎo)菌株個(gè)性化育種對(duì)工業(yè)菌株YJS329(Z5)和實(shí)驗(yàn)室菌株BYZ1進(jìn)行表型比較分析，發(fā)現(xiàn)Z5在對(duì)多種環(huán)境脅迫因子耐性和發(fā)酵性能上要優(yōu)于BYZ1。兩菌株在海藻糖、質(zhì)膜成分和抗氧化因子等生化因子的含量上也有明顯差異。脈沖場凝膠電泳(PFGE)和比較基因組雜交結(jié)果表明，Z5是一株核型規(guī)則的二倍體菌株。利用二代高通量測序技術(shù)對(duì)Z5的一株單倍體菌株YJ

5、SH1進(jìn)行深度測序和從頭組裝，并與S288c基因組進(jìn)行了SNP、進(jìn)化關(guān)系、Indel和ORF的差異分析。利用RNA-Seq研究了該兩株菌株的表達(dá)譜，在基因表達(dá)水平上對(duì)兩株菌株的表型差異進(jìn)行機(jī)制探討。重點(diǎn)分析了轉(zhuǎn)錄因子MSN2/4，HAP1，HSF1，和ARR1自身表達(dá)差異原因和對(duì)整個(gè)表達(dá)譜和菌株表型的影響。同時(shí)結(jié)合基因組序列信息舉例分析了一些SNPs、Indels和基因拷貝數(shù)變化對(duì)基因表達(dá)的影響。在了解Z5基因組信息以及一些序列變異對(duì)表

6、型的影響后，用基因操作的方法對(duì)Z5進(jìn)行針對(duì)性的分子改造，并提出了比較功能基因組學(xué)指導(dǎo)微生物個(gè)性化育種的育種新理念。
　　 3、基因組結(jié)構(gòu)變異對(duì)菌株表型的影響及其機(jī)制利用PFGE和比較基因組雜交對(duì)菌株Z2-7進(jìn)行了基因組結(jié)構(gòu)比較，結(jié)果顯示Z3和Z5是二倍體菌株，Z2，Z4，Z6和Z7是非整體菌株，在多條染色體上發(fā)生大片段的擴(kuò)增現(xiàn)象。綜合菌株Z2-7的DNA序列進(jìn)化關(guān)系、表型和生理生化的分析的結(jié)果，我們推測基因組結(jié)構(gòu)變異在這些菌株表

7、型分化中的作用可能比序列差異的作用大。通過對(duì)CUP1和YFL052W等特定基因的過表達(dá)和敲除發(fā)現(xiàn)這些基因的拷貝數(shù)變化會(huì)對(duì)菌株的表型產(chǎn)生顯著影響。此外，對(duì)Z7和Z5在生長和發(fā)酵條件下的表達(dá)譜和生理生化比較研究發(fā)現(xiàn)，“非整倍壓力應(yīng)激”可能是這些菌株脅迫耐性和發(fā)酵性能差異的重要機(jī)制。
　　 4、通過基因組結(jié)構(gòu)變異改進(jìn)菌株的復(fù)雜性狀對(duì)Z7進(jìn)行多輪的基因組重構(gòu)后，獲得濃醪發(fā)酵性能顯著提高的SV突變株，證明了基因組變構(gòu)能有效改進(jìn)酵母菌株的復(fù)

8、雜性狀。其中一株突變株ZTS3較Z7在乙醇產(chǎn)量上提高6.6％，而且對(duì)乙醇、H2O2和高溫的耐受性也明顯改進(jìn)。ZTS3相對(duì)于Z7來說在多條色體上發(fā)生了大片段的拷貝數(shù)增多或減少。我們證明了基因YFL052W拷貝數(shù)和表達(dá)量的增加是ZTS3多種脅迫耐性提高的一個(gè)重要原因。對(duì)ZTS3和Z7所有差異基因的功能分類及相關(guān)生理代謝分析發(fā)現(xiàn)，ZTS3的非整倍壓力應(yīng)激反應(yīng)要少于Z7，具體反映在參于核苷酸等小分子的合成、細(xì)胞增殖、海藻糖和抗氧化因子等抗逆因子