基于滾環(huán)擴增技術(shù)和納米材料的生物傳感新方法的研究.pdf

1、生命體中蛋白質(zhì)、核酸、酶活性以及生物小分子活動信息的研究對生物醫(yī)學(xué)以及臨床診斷和治療有著非常巨大的意義。如何實時、動態(tài)、快速、準(zhǔn)確地獲取這些生命活動的信息，就成為了分析化學(xué)科研工作者面臨的重大的挑戰(zhàn)。為了克服這個難題，就需要我們發(fā)展一些準(zhǔn)確性高、靈敏度高以及特異性高的定性或定量的方法，達(dá)到獲取信息的目的。本論文瞄準(zhǔn)上述挑戰(zhàn)進(jìn)行研究，基于滾環(huán)擴增技術(shù)和納米材料發(fā)展了一系列分別以小分子、核酸、蛋白質(zhì)和酶活性為檢測對象的高靈敏性高選擇性的生物

2、傳感技術(shù)，并通過對實際樣品的分析，初步驗證了這些技術(shù)的可行性和準(zhǔn)確性。
　　第2章中，單個細(xì)胞中microRNA的空間分布和表達(dá)水平對于考察microRNA及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性在生物學(xué)中的作用具有十分重要的意義。我們開發(fā)一種基于目標(biāo)自引物等溫滾環(huán)擴增技術(shù)高靈敏高選擇性的原位檢測腫瘤細(xì)胞microRNA。該方法，首先利用改良的microRNA固定方法，將microRNA的5'端磷酸基團與細(xì)胞中蛋白質(zhì)的氨基通過EDC共價交聯(lián)，達(dá)到固定

3、microRNA的目的。然后預(yù)先制備的DNA環(huán)狀探針與microRNA經(jīng)過原位雜交，microRNA作為引物，在dNTPs和聚合酶的作用下進(jìn)行滾環(huán)擴增反應(yīng)，產(chǎn)生一條長的與環(huán)形DNA模板互補的單鏈DNA。細(xì)胞原位產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物利用熒光染料標(biāo)記的探針雜交識別，由于滾環(huán)擴增產(chǎn)物可以與成千上萬的熒光染料標(biāo)記探針雜交，從而達(dá)到目標(biāo)microRNA高靈敏的可視化的檢測。由于滾環(huán)擴增反應(yīng)只能由microRNA游離的3'端觸發(fā)，因此從根本上消除了mRN

4、A以及microRNA前體的干擾。我們使用這種方法來實現(xiàn)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人正常細(xì)胞株L02細(xì)胞中mir-222與mir-223表達(dá)水平的高靈敏的可視化檢測，并進(jìn)一步實現(xiàn)了單個細(xì)胞中不同microRNA的同時檢測。我們認(rèn)為目標(biāo)觸發(fā)的基于目標(biāo)自觸發(fā)滾環(huán)擴增原位檢測方法是可靠的研究疾病相關(guān)的microRNA表達(dá)分析方法，在基礎(chǔ)研究和臨床診斷上具有很大的應(yīng)用潛力。
　　第3章中，DNA甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，在

5、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的過程中通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性以及與蛋白質(zhì)相互作用方式等途徑來實現(xiàn)。DNA甲基化目前已成為多種腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。高靈敏高特異性的檢測CpG島DNA甲基化表型對于甲基化的研究和臨床診斷都具有非常重大的意義。在本章中，我們將滾環(huán)擴增技術(shù)與DNA為模板形成熒光特性的銀納米簇相結(jié)合發(fā)展了一種可用于實際體系中DNA甲基化檢測的方法。該方法首先將DNA經(jīng)過亞硫酸鹽的處理，再利用EcoliDNA連接酶對錯配的堿基對高特

6、異性識別，在進(jìn)行退火連接-變性解鏈的熱循環(huán)過程中，亞硫酸鹽處理后的甲基化的目標(biāo)DNA與經(jīng)過合適設(shè)計的與其具有完全互補堿基對的掛鎖探針雜交，通過連接酶的作用下產(chǎn)生連接產(chǎn)物，該連接產(chǎn)物自身具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并有完整的限制性內(nèi)切酶識別位點。銀納米簇DNA模板作為引物，在具有強鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下自發(fā)啟動聚合酶延伸反應(yīng)以及鏈置換的恒溫滾環(huán)放大反應(yīng)，隨后在限制性內(nèi)切酶的作用下，釋放出大量可以合成銀納米簇的DNA模板。在硝酸銀、硼氫化鈉的作

7、用下，產(chǎn)生熒光信號，從而可實現(xiàn)目標(biāo)DNA甲基化的檢測。該方法設(shè)計巧妙新穎，有較高的靈敏度和選擇性，檢測限達(dá)6.4fM。
　　第4章中，基于鳥嘌呤可觸發(fā)DNA為模板合成銀納米簇?zé)晒庠鰪姷男再|(zhì)發(fā)展了一種高靈敏檢測腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的分析方法。在該方法中，我們設(shè)計了一條包含合成銀納米簇模板的端粒酶擴增引物序列，未存在端粒酶的時候，此模板合成出熒光信號很弱的銀納米簇。在目標(biāo)端粒酶的作用下，引物進(jìn)行擴增，擴增出富含G堿基的TTAGGG重復(fù)

8、序列，此時合成銀納米簇不僅使得熒光信號有很大的增強，同時熒光發(fā)射波譜紅移。這種方法實現(xiàn)了對Hela細(xì)胞中端粒酶活性的高靈敏檢測，動態(tài)響應(yīng)范圍為500到50000個細(xì)胞，并且在該范圍內(nèi)峰熒光信號與HeLa細(xì)胞個數(shù)的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，同時該方法具有較高選擇性，線性范圍寬，高靈敏度等優(yōu)點。
　　第5章中，基于核酸適配體探針可自組裝在二硫化鉬納米片的表面上形成穩(wěn)定的適配體-二硫化鉬納米片結(jié)構(gòu)的生物傳感器，發(fā)展了一種高靈敏的蛋白質(zhì)和生

9、物小分子的檢測新方法。修飾了熒光素的核酸適配體探針自組裝在二硫化鉬納米片的表面，依舊保持核酸適配體高的特異性和親和力。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)可以作為低背景的平臺用于ATP和凝血酶的檢測。當(dāng)靶目標(biāo)不存在時，熒光探針與MoS2發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光被顯著淬滅。當(dāng)靶目標(biāo)存在的情況下，靶物質(zhì)與核酸適配體結(jié)合具有高的特異性和親和力，誘導(dǎo)核酸適配體其形成更加剛性的分子結(jié)構(gòu)，這種剛性結(jié)構(gòu)的形成減弱了核酸適配體與MoS2的之間的范德華力作用，使得核酸適配體不

10、能被MoS2有效的吸附淬滅，適配體探針與靶目標(biāo)結(jié)合脫離二硫化鉬納米片的表面，熒光恢復(fù)。該方法設(shè)計簡單、操作簡便、靈敏度高選擇性好，也可以通過靈活的使用不同的核酸適配體和DNA修飾上不同的熒光基團應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域多組分物質(zhì)的同時檢測。
　　第6章中，多聚核苷激酶(PNK)對DNA的磷酸化修飾過程在許多的生理活動中起著非常重要的作用。本章以T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4PNK)為模型，基于

11、磷酸化的DNA被特異性外切酶降解結(jié)合WS2獨特的吸附和淬滅性能發(fā)展了一種熒光方法用于T4PNK酶活性的測定。由于WS2與雙鏈DNA的結(jié)合力較弱不能有效淬滅染色雙鏈產(chǎn)物的熒光，因此得到較強的熒光信號。雙鏈DNA作為T4PNK的底物，當(dāng)T4PNK作用之后，雙鏈DNA模板將被磷酸化，導(dǎo)致雙鏈DNA立即被λ核酸外切酶降解，產(chǎn)生得到的單鏈DNA被WS2強烈吸附同時淬滅其熒光。WS2的超強熒光淬滅能力也為該方法提供了有較寬的線性范圍和低的檢測限，其