DNA核酶滾環(huán)擴(kuò)增及金屬納米簇傳感方法研究.pdf

1、隨著科學(xué)研究的快速發(fā)展，功能核酸的發(fā)現(xiàn)使人們的視野得到了拓寬，使人們對核酸只作為載體用來轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲遺傳信息的傳統(tǒng)觀念得以打破，使人們對核酸的理解進(jìn)一步加深，并且為研究生物分子領(lǐng)域提供了一種新的活性物質(zhì)。同時，由于具有容易操作、特異性強(qiáng)和高的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。利用單鏈DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇，由于具有良好的光學(xué)和光物理特性，近年來已發(fā)展成為常用的納米熒光探針。本文借助DNA核酶分子機(jī)器及滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，并結(jié)合

2、銀納米簇等熒光納米探針技術(shù)，以銅離子、核酸酶及氨基酸為檢測對象，開展以下主要工作:
　　構(gòu)建了一種以DNA核酶分子機(jī)器及滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)為基礎(chǔ)的熒光法用于銅離子(Cu2+)的定量檢測。在無銅離子的情況下，模板鏈競爭奪取核酶底物鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對，當(dāng)存在E.coli DNA連接酶時，使模板鏈連接成環(huán)，繼而以底物鏈作為引物，當(dāng)存在phi29DNA聚合酶時，可以引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(RCA)，產(chǎn)生長的DNA鏈產(chǎn)物，可雜交事先設(shè)計好的分子信標(biāo)，繼而使

3、體系產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號。當(dāng)存在銅離子時，銅離子誘發(fā)DNA核酶底物鏈的斷裂，斷裂的底物鏈無法在E.coli DNA連接酶存在時，使模板鏈連接成環(huán)，繼而不能使RCA有效進(jìn)行，最終導(dǎo)致體系的熒光信號大幅度降低。此傳感器在Cu2+含量1nM～4μM范圍內(nèi)產(chǎn)生優(yōu)良的線性響應(yīng)性能，R=0.9947，計算得出可檢測銅離子的最低含量為0.6792nM。該方案有很好的反應(yīng)效益比，開拓采用DNAzyme分子機(jī)器及滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)用于有效測試金屬離子含量的生物傳感

4、器的新思路。
　　以單鏈DNA穩(wěn)定的銀納米簇作為功能化探針，開展了一種無標(biāo)記熒光法來對核酸酶(S1)進(jìn)行定量檢測。由于核酸酶(S1)可以特異性識別單鏈DNA，在最佳的環(huán)境條件下，可將其降解為單核苷酸或寡核苷酸片段。當(dāng)體系中有核酸酶(S1)存在時，作為模板的單鏈DNA被特異性識別并降解，導(dǎo)致熒光銀納米簇?zé)o法合成，致使體系的熒光強(qiáng)度信號降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在核酸酶(S1)含量持續(xù)增加時，銀納米簇的熒光信號強(qiáng)度不斷降低。在最優(yōu)的實(shí)

5、驗(yàn)條件下，體系的信號參數(shù)(F/F0)與S1核酸酶的含量在5×10-5～4×10-3U/μL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為2×10-6U/μL。該方法在RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中得到的回收率為91.75％～109.5％，因此該方法對樣品中S1核酸酶的檢測具有一定的可行性。
　　以DNA為模板合成銀納米簇，且在L-半胱氨酸(L-Cys)的存在下，L-Cys中的巰基(SH)奪取C-Ag+-C中的Ag+，使得無法形成銀納米簇從而銀納米簇的熒